近日，北京市农林科学院玉米DNA指纹及分子育种北京市重点实验室、齐鲁师范大学玉米分子育种研究院的共同研究成果，于2022年7月5日在Theoretical and Applied Genetics上发表(影响因子为5.574)，题目为“ A newly characterized allele of ZmR1 increases anthocyanin content in whole maize plant and the regulation mechanism of diferent ZmR1 alleles"。本文主要研究内容是鉴定了玉米花青素合成相关等位基因ZmR1CQ01，并揭示了3个ZmR1等位基因的生物学功能和分子调控机制。
研究背景
玉米中的花青素对人类的健康具有积极作用。R1基因家族调控花青素的组织特异性分布。R1基因的等位基因变异较为丰富，然而其生物学功能和分子调控机制尚不清楚。
研究材料
玉米自交系 CQ01、ZN3、B73、B104、WMR，京紫糯219 (ZN3×CQ01)，京724，京92、京科968 (京724×京92)，B73 zmr1 EMS突变体，以及本研究中用到的多个遗传材料。
研究结果
CQ01玉米植株的多种器官(叶鞘、叶脉、苞片、叶、茎、种子皮、支撑根等) 中都存在花青素色素沉着现象。然而B73植株的花青素主要积累在近地叶鞘和支撑根中。
图1：玉米自交系CQ01叶片中脉花青素含量和成分分析以及花青素调控基因的定位
(a)玉米自交系CQ01和B73的叶中脉。(b) CQ01生长30天后叶中脉的花青素含量。© LC-MS/MS在不同扫描波长下的信号强度。(d) LC-MS/MS检测花青素的保留时间和信号强度。(e) 花青素组成成分检测。(f)BSR-seq分析将花青素调控基因定位到10号染色体 (B73 RefGen_v3)。(g) 采用滑动窗口法将花青素调控基因定位到10号染色体132-140Mb区间。(h) 利用CQ01(紫色中脉)和ZN3(绿色中脉)之间具有SNP多态性的13个KASP分子标记，对465个京紫糯219 (ZN3×CQ01)的F2代个体进行精细定位，将叶中脉花青素调控基因定位于KASP-15和KASP-19标记之间的404kb区间。
通过CQ01和B73杂交的F2代种群分离实验 (绿色中脉:紫色中脉=1:3) 发现，CQ01的紫色叶中脉由一个显性基因控制。通过BSR-seq分析及精细遗传定位发现玉米叶中脉的花青素色素沉着由第10号染色体上的ZmR1基因控制。
图2：过表达ZmR1和过表达ZmR1CQ01的京724的不同组织中花青素的积累
(a) ZmR1过表达载体的结构。(b) 野生型京724和5个独立的过表达ZmR1CQ01的京724(T0代)中花青素积累的表现型。(c-m) 野生型京724和过表达ZmR1CQ01的京724的不同组织中的花青素积累。花青素在玉米粒©、胚芽鞘(d和e)、玉米须(f和j)、苞片(f和j)、叶(g和k)、叶中脉(g和k)、叶鞘(h和l)、茎(h和l)、花药(i和m)和雄花序(i和m)中积累。
图3：玉米zmr1 EMS突变体的等位基因检测及ZmR1的亚细胞定位
(a) 3个B73 zmr1 EMS突变体的突变位点和核苷酸变异情况。(b) 突变位点测序结果。(c-d) 野生型B73、3个B73 zmr1 EMS突变体©、2个突变体杂交植株和CQ01(d)的叶鞘中花青素积累的情况。(e) 通过对玉米原生质体的瞬时表达分析ZmR1的亚细胞定位。
玉米zmr1 EMS突变体的等位基因检测表明，叶鞘中的花青素色素沉着也受到ZmR1的控制。
图4：玉米自交系B73的叶鞘和叶片中花青素的积累和ZmR1的表达，以及在B104中过表达ZmR1B73后，叶中脉花青素积累增加
(a-b) B73和CQ01在叶鞘(a)和中脉(b)中的花青素积累。© B73生长30天后叶鞘中花青素的含量。(d)在生长30天的B73、CQ01和B73 zmr1 EMS突变体的叶鞘(靠近地面)、叶片和中脉中ZmR1的表达水平。(e)通过转录组分析鉴定生长30天的CQ01和B73叶中脉中ZmR1的FPKM值。(f) 生长30天的野生型B104和过表达ZmR1B73的转基因B104中花青素色素沉着的比较。(g-h) 过表达ZmR1B73的转基因B104和过表达ZmR1CQ01的转基因B104在生长30天时花青素色素沉着的比较。
ZmR1B73等位基因调控花青素在近地叶鞘中积累，而在叶片中脉没有积累。ZmR1B73在中脉的mRNA表达水平较低，因而没有花青素积累。过表达ZmR1B73可以促进花青素在中脉的积累。
图5：ZmR1ZN3的功能验证和功能分子标记物的开发
(a) 花青素不在ZN3的叶鞘和中脉积累。(b) 生长30天的ZN3和CQ01的叶片、中脉和叶鞘中ZmR1的表达量比较。© 通过zmr1 EMS突变体等位基因测试验证ZmR1ZN3的功能。(d) ZN3和CQ01的序列比对显示，在ZN3中缺失了ZmR1的第5个外显子。(e) ZmR1可编码三个保守结构域，其中bHLH-MYCN结构域由第5个外显子编码。(f) CQ01、ZN3和京紫糯219 (ZN3×CQ01)中分子标记的扩增片段大小。CQ01为315 bp，ZN3为272 bp，京紫糯219为272 bp和315 bp。(g) 玉米自交系WMR的分子标记鉴定结果与观察到的表型一致。利用所开发的分子标记，对432个田间玉米自交系进行了鉴定。WMR的扩增片段为272 bp。表型分析显示，WMR的叶鞘和中脉缺乏花青素的积累。
对ZN3和CQ01的序列比较显示，在ZN3中缺失了ZmR1的第5个外显子，导致ZmR1ZN3等位基因功能被破坏，因而在中脉和叶鞘中没有花青素积累。
图6：DAP-seq鉴定的ZmR1靶基因和RNA-seq鉴定的差异表达基因(DEGs)富集的代谢途径
(a)ZmR1结合的置信度高的两种motifs,“GATCAATGGCCA"和“GAGGWGTMBGWG"的motifs E值分别是 4.6e-311和1.3e-268。(b) 由DAP-seq鉴定的ZmR1的靶基因富集的前20个代谢途径。© RNA-seq分析CQ01和B73的中脉，鉴定了DEGs富集的前20个代谢途径。(d) RNA-seq分析野生型和过表达ZmR1CQ01的京724的叶片，鉴定了DEGs富集的前20个代谢途径。
DNA亲和纯化测序(DAP-seq)结果显示，ZmR1CQ01靶向了1010个基因，其中包括花青素合成途径中的Bz2。RNA-seq分析显示，ZmR1CQ01靶向的55个基因的表达水平显著改变，其中类黄酮和苯丙素生物合成途径中关键酶的基因表达显著上调。随后，又开发了ZmR1功能分子标记物。以上结果揭示了转录调控和序列变异对ZmR1功能的影响，并在全基因组水平上鉴定了ZmR1CQ01的靶基因。
图7：过表达ZmR1CQ01玉米京724的应用
(a) 过表达ZmR1CQ01京724植株由绿色变为紫色。(b)过表达ZmR1CQ01京724的紫色玉米将白酒变为红色。© 过表达ZmR1CQ01京724和京92杂交得到的田间玉米杂交种京科968植株是紫色的。
本文小结
本研究在玉米自交系CQ01的叶中脉中克隆了新的ZmR1等位基因。通过利用玉米EMS突变体、过表达ZmR1基因、分析序列差异、组织特异性表达分析、启动子甲基化水平分析、转录组和DAP-seq结果，揭示了ZmR1在多种组织中对花青素分布的影响及其分子调控机制。
通过分子育种策略，可以产生高花青素含量的玉米品系。过表达ZmR1CQ01，获得了一个花青素含量高的紫色玉米杂交种京科968。本研究开发的新R等位基因ZmR1CQ01及其功能分子标记，可通过分子标记辅助育种用于高花青素含量玉米新品种的遗传改良和分子设计育种。
蓝景科信河北生物科技有限公司为作者提供了DAP-seq技术支持。
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