DAP-seq在PuCRZ1调控猪苓菌丝生长及渗透胁迫耐受机制研究中的应用

猪苓（Polyporus umbellatus）是一种可食用的蘑菇，也是我国常用的菌类药材之一，至今已有2000多年的药用历史，在《神农本草经》、《本草纲目》、《本草求真》等典籍中均有记载。猪苓具有利尿、抗菌作用，近年来研究还发现具有抗癌作用。当前医药卫生业对猪苓的需求量逐年增加。但是，猪苓的野生资源越来越少，而且种植周期较长，单产较低。猪苓具有产生菌核的能力，然而，其菌核形成的分子机制尚不清楚。因此，研究猪苓的生长发育及其调控机制，发展优质高产的猪苓种系和栽培技术，将有助于缓解猪苓供应紧张的问题。

2023年4月6日，中国中医科学院中药资源中心黄璐琦院士/袁媛研究员课题组的研究成果，发表在Frontiers in Microbiology期刊上(影响因子6.064)，文章题目为“PuCRZ1, an C2H2 transcription factor from Polyporus umbellatus, positively regulates mycelium response to osmotic stress"。该研究使用DNA亲和纯化测序(DAP-seq)技术鉴定了猪苓中一个C2H2转录因子的结合基序及其靶基因，揭示了PuCRZ1参与调控猪苓菌丝生长以及渗透胁迫耐受的分子机制。

CRZ1（钙调神经磷酸酶反应性锌指转录因子）是C2H2家族转录因子，参与Ca²⁺-钙调神经磷酸酶信号通路，具有调节菌核形成、维持离子稳态和应对胁迫等功能。CRZ1同源物都具有一个或多个特征性C2H2锌指结构域，且它们的功能和调控基因在不同物种之间存在差异。目前，对于担子菌CRZ1基因的研究还很少，仅在灵芝中进行过研究。

该研究首先鉴定了猪苓基因组中包含28个C2H2转录因子。qRT-PCR检测发现，其中13个基因的转录水平在菌丝体和菌核之间存在差异，包括PuCRZ1。PuCRZ1基因全长801 bp，编码了一个包含266个氨基酸的蛋白质，是一个核定位蛋白。

图1. 通过DAP-seq鉴定PuCRZ1在全基因组的靶基因。

通过DAP-seq分析，鉴定到了PuCRZ1的保守结合基序为GTGGCG。KEGG富集分析发现，peak相关基因在抗生素生物合成、次级代谢产物生物合成、类固醇生物合成、自噬和内吞作用等信号通路中显著富集，并从KEGG通路显著富集的基因中发现了12个可能与猪苓菌核形成相关的基因。于是，进一步采用qRT-PCR鉴定到3个在菌丝体和菌核之间存在显著差异表达的靶基因PuG10、PuG11、PuG12。酵母单杂交（Y1H）和凝胶阻滞实验（EMSA）进一步验证了PuCRZ1可以结合到PuG10、PuG11和PuG12的启动子区域。

图2. 在不同处理条件下，转基因猪苓菌株的菌落形态和生长速率。

在酵母中过表达PuCRZ1基因后，降低了酵母细胞对NaCl和CaCl₂的敏感性。之后，通过农杆菌介导的遗传转化，在猪苓中分别构建了过表达PuCRZ1、PuG10、PuG11和PuG12的转基因菌株。然后，分别接种到20 mM NaCl、5 mM CaCl_2、150 mM Mannitol培养基上。生长30天后，观察发现PuCRZ1过表达菌株在NaCl和CaCl₂培养基中的菌落直径小于野生型菌株（WT），表明PuCRZ1过表达菌株对Na⁺和Ca²⁺更敏感。PuG10、PuG11、PuG12过表达菌株在NaCl和CaCl₂培养基中的菌落直径无明显差别，却在对照培养基和Mannitol培养基上均明显大于WT菌株，其中PuG11过表达菌株的菌落直径最大。这表明PuCRZ1调控的三个靶基因PuG10、PuG11、PuG12均可以提高菌丝体生长速度和对Mannitol胁迫的耐受性。以上结果表明PuCRZ1基因不直接调节对离子和渗透胁迫的耐受性，而是通过其靶基因对胁迫作出反应。

此外，还发现PuG11基因编码的蛋白含有FYVE结构域，这是一种锌指结合结构域。因此，该研究扩展了对真菌中含有FYVE结构域蛋白的功能和机制的理解。

图3. CRZ1及其靶基因在Ca2+-钙调神经磷酸酶信号通路中的调控机制图。

总结：该研究首先将DAP-seq技术应用于药用真菌的研究，为基因及分子间相互作用研究提供了新的技术借鉴。该研究揭示了PuCRZ1-钙调神经磷酸酶信号通路在猪苓菌丝体生长以及渗透胁迫耐受中起重要作用，弥补了国际上对猪苓CRZ1以及含FYVE结构域蛋白功能研究的空白，也为深入开展猪苓菌核形成机制的研究提供了理论依据。

参考文献：Han P, Hua Z, Zhao Y, Huang L, Yuan Y. PuCRZ1, an C2H2 transcription factor from Polyporus umbellatus, positively regulates mycelium response to osmotic stress. Front Microbiol. 2023 Apr 6;14:1131605. doi: 10.3389/fmicb.2023.1131605.

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