客户文章 ▏DAP-seq技术助力揭示水稻氮素吸收直接途径和菌根途径的新机制

2025年2月18日，南京农业大学徐国华、陈爱群教授团队在PNAS期刊(IF=9.4)上发表了题为“OsNLP3 and OsPHR2 orchestrate direct and mycorrhizal pathways for nitrate uptake by regulating NAR2.1-NRT2s complexes in rice"的研究论文，该研究利用DAP-seq技术，系统的阐明了两个转录因子OsNLP3和OsPHR2协同调控硝酸盐转运蛋白复合体NAR2.1-NRT2s介导的氮素吸收直接途径和菌根途径的分子机制。

研究背景

氮（N）是植物生长必需的营养元素，大多数陆地植物进化出了两种氮吸收途径：一种是直接通过根系吸收的途径，另一种是通过与丛枝菌根（AM）真菌共生的途径。然而，这两种途径在硝酸盐吸收过程中的相互作用尚不明确。

研究结果

采用分区培养系统研究发现，水稻通过菌根吸收硝酸盐的途径比吸收铵更高效。葡糖醛酸酶（GUS）实验显示AM共生促进硝酸盐吸收和同化，上调相关还原酶基因表达，且在含丛枝细胞中表达增强。

为了鉴定更多对水稻AM共生硝酸盐吸收有重大贡献的候选基因，作者通过qPCR分析，筛选出对硝酸盐吸收具有关键作用的转运基因：OsNRT2.1、OsNRT2.2和OsNRT2.3，以及编码促进NRT2蛋白转运到质膜的伴侣蛋白基因OsNAR2.1。葡糖醛酸酶（GUS）实验显示OsNAR2.1和OsNRT2s在菌根细胞中的表达显著上调，这些基因在共生硝酸盐吸收中起重要作用。

随后，通过在osnar2.1敲除株系和野生型（WT）植株中研究发现，OsNAR2.1功能丧失导致非菌根化和菌根化根中OsNRT2.1/2.2/2.3的表达降低，说明OsNAR2.1介导的运输系统对于收硝酸吸收的直接途径和菌根途都是必需的。由于玉米ZmNAR2.1也显示出 AM 诱导的表达模式，进一步研究发现玉米ZmNAR2.1也参与共生硝酸盐吸收，这表明该途径在禾本科物种中保守。

NLPs 被认为是硝酸盐信号传导中的主要转录因子，在陆地植物中广泛保守，研究发现OsNLP3在调节硝酸盐吸收直接和菌根途径中起到关键作用。为了进一步研究OsNLP3转录因子对硝酸盐吸收和代谢的调控机制，作者进行了酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率变动分析（EMSA）和染色质免疫共沉淀ChIP-qPCR分析，结果显示OsNLP3能够直接结合到OsNAR2.1启动子的NRE-like1和NRE-like3基序上。荧光素酶报告基因分析结果显示，OsNLP3激活OsNAR2.1启动子。

OsNAR2.1、OsNRT2.1和OsNRT2.2的启动子中至少有一个拷贝的PHR结合序列，因此推测，OsPHRs是否也可以调控硝酸盐吸收。EMSA 、Y1H、荧光素酶报告实验显示，OsPHR1/2/3可以结合并激活OsNRT2.1、OsNRT2.1和OsNRT2.2的启动子。osphr2突变体表现出降低的菌根共生效率和氮吸收能力，这说明OsPHR2正调控菌根硝酸盐吸收途径。

OsSPX4作为主要的细胞内磷传感器，能够通过与OsPHR2和OsNLP3相互作用，整合磷和硝酸盐信号通路。为了确定OsSPX4是否能够干扰OsPHR2或OsNLP3对OsNAR2.1的激活，作者在烟草叶片中进行了共转化实验，结果显示OsSPX4 能够显著抑制OsPHR2或OsNLP3对LUC的激活。通过进一步对OsSPX4功能的研究发现，OsSPX4可能通过与OsPHR2和OsNLP3的相互作用来调控菌根共生硝酸盐和磷酸盐吸收途径。

为了更深入地了解OsNLP3调控菌根共生和共生硝酸盐吸收的机制，作者进行了DNA亲和纯化测序（DAP-seq），共鉴定出超过84,000个潜在的OsNLP3靶标区域，大约21%的结合位点位于启动子区域。Motif富集分析发现，TGA(C)CCCT(C) 是OsNLP3结合位点显著富集的基序。鉴于OsPHR2和OsNLP3共同调控共生硝酸盐吸收，对OsNLP3和OsPHR2的潜在靶基因与在AM共生根中的差异表达基因（DEGs）进行了重叠分析。发现，在AM共生根中上调的1,122个基因同时也是OsNLP3和OsPHR2的共同靶基因。这些靶基因包括多个参与氮吸收和代谢的关键基因，例如NAR2.1、NRT2s、NPF4.5和NiR1。此外，一些在AM启动和丛枝发育中起关键作用的基因也被鉴定为靶基因，例如SL生物合成基因D10和D17、脂质生物合成基因RAM2，FatM和DMI3。

通过在水稻原生质体中进行转录激活实验，发现D17、NiR1、DMI3和OsRLI1的启动子可以被OsNLP3和OsPHR2分别激活，从而证实了DAP-seq的结果。此外，除了RLI1在osnlp3菌根共生根中的表达水平与野生型菌根共生根相比没有显著变化外，其他选定基因在osnlp3和osphr2突变体的菌根共生根中表现出显著下调。这些结果表明，OsPHR2和OsNLP3共同调控共生硝酸盐吸收和AM共生途径。

研究结论

该研究阐明了协调氮素吸收的直接途径和菌根途径的作用机制，完善了菌根氮素营养的调控网络，为进一步利用菌根途径提高作物氮素利用效率提供了理论基础和重要基因资源。