文章名称：Double DAP-seq uncovered synergistic DNA binding of interacting bZIP transcription factors
期刊：Nature communications
发表时间：2023年5月5日
一、研究背景
转录因子（TF）相互作用对基因表达的组合调控至关重要，bZIP转录因子的二聚化对其功能发挥意义重大，但同源和异源二聚体在DNA结合和功能特异性方面的分子机制尚不清楚。此前研究多使用合成寡核苷酸，无法充分体现基因组的序列多样性和结合位点背景。为深入探究TF相互作用如何影响DNA结合特异性，本文开发了双DNA亲和纯化测序（dDAP-seq）技术，以研究拟南芥中bZIP转录因子的二聚体结合位点。
二、dDAP-seq技术原理
dDAP-seq是在DAP-seq基础上改进而来。在dDAP-seq中，同时体外表达两个分别融合不同亲和标签的转录因子，即SBPTag-TF1和HaloTag-TF2，且使SBPTag-TF1表达量更高，促使HaloTag-TF2与之形成异源二聚体。将表达的蛋白与片段化的基因组DNA孵育后，利用HaloTag配体偶联的磁珠特异性捕获含有HaloTag-TF2的蛋白或蛋白复合物及其结合的DNA片段，随后对回收的DNA进行测序。通过这种方法，能够在全基因组范围内定位相互作用转录因子的结合位点。
三、研究思路
1. 技术开发与验证
鉴于单独使用DAP-seq无法检测到拟南芥C bZIP的DNA结合位点，推测C组与S1组bZIP形成异源二聚体可能增加DNA结合能力，从而开发dDAP-seq技术。利用该技术对20对C/S1 bZIP异源二聚体和S1同源二聚体进行全基因组结合位点分析，并通过多种方法验证dDAP-seq数据的可靠性。
2. 结合位点特征分析
研究C/S1二聚体在不同组织和发育阶段的共表达模式，分析其全基因组结合位点的相关性和序列基序，探究异源二聚体与同源二聚体DNA结合偏好的差异，以及这些差异与二聚体功能特异性的关系。
3. 功能验证
将dDAP-seq鉴定的S1:C异源二聚体结合事件与RNA-seq数据相结合，分析差异表达基因，确定二聚体结合与基因表达调控的关系。通过GO富集分析，探究C/S1二聚体潜在的生物学功能。针对bZIP9和bZIP53这两个关键转录因子，深入研究其异源二聚体的功能和DNA结合特异性。
四、研究结果
1. dDAP-seq鉴定bZIP C/S1异源二聚体结合位点
dDAP-seq成功检测到S1:C异源二聚体的大量结合位点，而单独使用DAP-seq时C bZIP无显著峰值富集。数据显示，S1:C异源二聚体的结合位点与S1同源二聚体及其他bZIP组的结合位点存在显著差异，许多异源二聚体的结合位点是不同的，表明C和S1 bZIP可能具有协同功能。
图1 通过DAP-seq和dDAP-seq系统鉴定bZIP C/S1 bZIP同源二聚体和异源二聚体的结合位点。
2. C/S1 bZIP二聚体全基因组结合特征
通过S1和C基因的共表达模式分析发现S1和C基因在多个组织和发育阶段共表达，这表明不同S1:C异源二聚体可能在多个组织中形成。这就增加了不同 S1:C 异源二聚体对功能冗余的可能性，同时也表明仅靠表达模式来了解它们之间的功能差异是有限的。随后通过结合位点分析发现，异源二聚体（S1组与C组结合）改变了S1组bZIP的DNA结合偏好，不同的异源二聚体具有不同的二级基序富集模式，这些模式与全基因组结合相关性聚类结果相符。
图2 C/S1 bZIP二聚体全基因组结合相关性及DNA序列基序概述。
3. dDAP-seq揭示二聚体调控的基因表达
为了确定dDAP-seq鉴定出的S1:C异源二聚体结合事件是否能够调控基因表达，作者比较了DAP-seq，dDAP-seq和RNA-seq数据，发现S1和S1:C二聚体的预测靶基因在bzipS1突变体的下调差异表达基因中显著富集，表明DAP-seq或dDAP-seq预测的C/S1二聚体靶基因在植物体内受S1 bZIP转录调控。对bZIP1靶基因的分析显示，dDAP-seq在其近端启动子区域有强烈的读数富集，且在瞬时靶基因上的结合信号更强，说明这些靶基因可能也受含bZIP1的S1:C异源二聚体调控。
图3 dDAP-seq鉴定C/S1 bZIP转录因子的直接靶基因及其潜在的功能。
4. C/S1二聚体靶基因的功能富集分析
GO富集分析表明，S1和S1:C二聚体的靶基因在响应非生物胁迫、光、碳水化合物代谢过程等生物过程中显著富集。部分异源二聚体的靶基因与缺氧响应相关，这与C/S1 bZIP在种子发育中的重要作用相关。此外，不同二聚体的靶基因在响应茉莉酸、水杨酸等激素以及信号调节等方面存在差异，体现了异源二聚体DNA结合导致的功能多样性（图3 c）。
5. bZIP9异源二聚体靶基因分析揭示其在ABA响应中的功能
由于异源二聚体对DNA结合很重要，C bZIPs的直接靶基因表征有限，而且由于CbZIPs成员之间存在高度冗余，研究其生物学功能具有挑战性。作者假设S1:C bZIPs的dDAP-seq结果可以帮助揭示C bZIPs的功能，并选择通过聚焦于bZIP9来探索这一假设。
对bZIP9异源二聚体靶基因的GO分析发现，其显著富集在响应脱落酸（ABA）等生物学过程。bZIP9异源二聚体在ABA响应标记基因RD29A和RD29B的启动子区域有强烈结合信号，且共转染bZIP9和S1 bZIP可显著激活报告基因GUS表达，突变相关基序后激活作用减弱。与野生型相比，bzip9突变体中RD29A和RD29B在ABA处理后的表达显著降低，这些结果表明bZIP9通过与S1 bZIP异源二聚化参与ABA响应调控。
图4 bZIP9 介导脱落酸（ABA）响应。
6. bZIP53异源二聚体DNA结合特异性分析
为了系统地研究bZIP53异源二聚体对种子发育的作用，作者比较了bZIP53异源二聚体和同源二聚体的结合位点，发现bZIP53异源二聚体特异性结合位点与种子成熟阶段特异性表达的基因相关，表明其在种子成熟过程中发挥重要作用。对bZIP53异源二聚体特异性结合位点的基序分析发现，其主要富集的基序包括含TGAC核心序列、ACGTG核心序列和TGACTCA序列的基序，这些基序与酵母bZIP GCN4的结合位点相关。bZIP53与C bZIP共转染，导致PUMP1:GUS报告基因的表达显著增加，而突变 TGAC 半位点（mut1）、ACGTG 元件（mut2）或同时突变两者（mut1&2）会降低GUS表达。基于此，作者提出了bZIP53同源二聚体和异源二聚体的DNA结合特异性模型。
图5 靶基因和基序差异揭示了bZIP53:bZIPC异源二聚体的特异性。
7. C/S1二聚体改变DNA结合特异性的一般模式
为了探究在bZIP53异源二聚体特异性结合中识别出的序列模式是否也适用于其他S1组bZIP转录因子，我们计算了通过比较S1:C异源二聚体的dDAP-seq数据和相应的S1组同源二聚体的DAP-seq数据所获得的异源二聚体特异性峰值与同源二聚体特异性峰值中这些模式的相对富集程度。研究发现，C/S1二聚体存在两种基序富集模式。Type I中，同源二聚体偏好GCN4样基序，异源二聚体偏好ACGTG元件；Type II中则相反。这表明尽管ACGTG元件在所有C/S1二聚体中均高度富集，但异源二聚体仍存在特异性结合，且这种特异性与酵母bZIP GCN4识别的序列元件相关。
图6 bZIP C/S1二聚体的不同DNA结合特异性模式。
五、研究结论
dDAP-seq技术能够在体内基因组背景下绘制相互作用转录因子的全基因组结合位点，为研究转录因子相互作用如何调节结合特异性、潜在靶基因和生物学功能提供了有力工具。通过该技术对拟南芥bZIP C/S1二聚体的研究，揭示了异源二聚化对bZIP转录因子DNA结合偏好和功能特异性的重要影响，为深入理解植物基因表达的组合调控机制奠定了基础。未来，dDAP-seq技术可进一步应用于研究其他转录因子家族的异源二聚体，以及在不同物种中探究DNA结合特异性的进化。
咨询电话