New Phytol（IF=8.1）▏DAP-seq技术助力揭示水稻免疫调控分子机制

文献题目：ONAC122 and ONAC131, controlled by OsSRWD1, OsRACK1A, and OsRGLG2, regulate rice immunity through modulating OsRFPH2-2 and OsBIERF3

发表期刊：New Phytologist

影响因子：8.1

物种：水稻

作者单位：浙江大学

发表时间：2026年2月24日

蓝景科信提供：DAP-seq技术服务

主要研究结果

植物先天免疫系统是其抵御病原菌侵染的核心防线，主要包括病原/微生物/损伤相关分子模式触发的免疫（PTI）和效应因子触发的免疫（ETI）两大层面。二者通过启动复杂的信号级联反应，激活NAC、WRKY、ERF等多个家族的转录因子（TFs），驱动免疫相关基因的转录重编程，最终实现对病原菌的抗性响应。稻瘟病由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起，是水稻生产中破坏性的真菌病害之一，严重威胁全球粮食安全。解析水稻抗稻瘟病的分子调控网络，挖掘关键抗病基因，是培育抗病水稻品种的核心基础。

NAC转录因子是植物的核心转录因子家族，其N端为保守DNA结合域，C端为转录调控可变域，在生长发育与逆境应答中至关重要。水稻151个NAC成员中已有21个被证实参与免疫调控，其中ONAC122和ONAC131可正向调控稻瘟病抗性，但其作用机制、靶基因、上游调控及结合元件等关键科学问题仍未阐明。

该研究利用RNA-seq比较onac122、onac131突变体、过表达株系与野生型的转录组差异，GO与KEGG富集分析表明，相关差异表达基因主要富集在植物-病原菌互作、MAPK 信号通路等免疫相关通路。进一步通过DAP-seq鉴定ONAC122全基因组结合位点，其中24.6%富集于基因启动子区，且其核心结合顺式作用元件为经典的CACG，同时鉴定出其可结合的新型ACTC元件。随后通过酵母双杂交、双分子荧光互补及免疫共沉淀实验证实，ONAC122与ONAC131可形成同源及异源二聚体，ONAC131不直接激活靶基因，但可协同增强ONAC122对OsRFPH2-2和OsBIERF3的转录激活。而OsSRWD1和OsRACK1A作为互作蛋白，特异性增强ONAC122的转录活性，正向调控该模块的免疫功能；而具有E3泛素连接酶活性的OsRGLG2，则通过泛素化修饰并经26S蛋白酶体途径降解ONAC122和ONAC131，抑制其功能，进而负调控水稻对稻瘟病的抗性。

该研究不仅为水稻抗稻瘟病的分子机制研究奠定了重要基础，也为植物先天免疫系统的调控研究提供了新的视角，其研究成果兼具理论价值和应用价值，对保障水稻生产安全、推动植物抗病分子育种发展具有重要意义。

图1. ONAC122和ONAC131在水稻稻瘟病抗性及几丁质触发的病原相关分子模式诱导免疫（PTI）中的正调控作用。（a~f）ONAC122（a~c）和ONAC131（d~f）正向调控水稻的稻瘟病抗性。采用打孔接种法，向onac122突变体、ONAC122过表达株系、onac131突变体、ONAC131过表达株系及ZH11的代表性叶片接种10 uL稻瘟病菌RB22菌株的孢子悬浮液（浓度为5×10⁵个・mL^-1）后，观察叶片的病害症状（a、d）、测定病斑长度（b、e）并检测稻瘟病菌在植株体内的相对生物量（c、f）。在接种后第5天记录病害表型并采集叶片样品（比例尺=0.2 cm）。采用荧光定量PCR法对病菌相对生物量进行定量分析，以稻瘟病菌MoPot2基因的表达量相对于水稻泛素基因OsUbi的表达量的倍数表示。图b、c、e、f中数据以平均值±标准误表示，其中b、e的样本量n=27，c、f的样本量n=9。（g、h）几丁质处理后，onac122突变体、ONAC122过表达株系（g）以及onac131突变体、ONAC131过表达株系（h）中的活性氧（ROS）爆发情况。（i、j）几丁质处理后，onac122突变体、ONAC122过表达株系（i）以及onac131突变体、ONAC131过表达株系（j）和ZH11植株中OsWRKY45基因的表达变化。将水稻叶圆片在水中过夜预培养后，用浓度为100ug・mL^-1的几丁质处理，以清水处理作为阴性对照；立即检测化学发光信号，以相对光单位（RLU）表示检测结果（g、h）。在处理后指定时间点采集叶片样品，进行基因表达分析，以水稻18SrRNA基因为内参对数据进行标准化处理（i、j）。图g、h中数据以平均值±标准误表示，样本量n=3；图i、j中样本量n=9。注：b、c、e、f中**表示与ZH11相比，差异极显著（P<0.01，Student's t检验）；i、j中不同字母表示组间差异显著（P<0.05，单因素方差分析）。所有实验均独立重复3次，结果一致。

图2. 转录组测序分析水稻onac122突变体、ONAC122过表达株系、onac131突变体及ONAC131过表达株系中的差异表达基因。（a）韦恩图展示未接稻瘟病菌时，与ZH11相比，在onac122和onac131突变体中下调、且在ONAC122和ONAC131过表达株系中上调的差异表达基因分布情况。（b、c）与ZH11相比，ONAC122和ONAC131过表达株系中上调基因（b）、onac122和onac131突变体中下调基因（c）的GO功能富集分析结果。（d、e）与ZH11相比，ONAC122和ONAC131过表达株系（d）、onac122和onac131突变体（e）中免疫相关基因的表达变化。（f、g）经稻瘟病菌接种或未接种处理后，onac122突变体、ONAC122过表达株系（f），以及onac131突变体、ONAC131过表达株系（g）和ZH11中筛选出的免疫相关基因的表达模式。对三周龄水稻植株采用叶面喷雾法接种稻瘟病菌RB22菌株的孢子悬浮液（浓度为2×10⁵个・mL-1），并以0.05%的吐温-20喷雾处理作为空白对照；在接种后指定时间点采集叶片样品进行基因表达分析，以水稻18SrRNA基因为内参对数据进行标准化处理。图f、g中数据以平均值±标准误表示，样本量n=3；不同字母表示组间差异达到显著水平（P<0.05，单因素方差分析）。所有实验均独立重复3次，实验结果一致。

图3. 水稻ONAC122的全基因组结合位点及ONAC122、ONAC131对CACG和ACTC顺式作用元件的结合活性。（a）经DAP-seq分析得到的两个生物学重复中，ONAC122高可信度结合峰的统计结果。（b）DAP-seq分析鉴定的ONAC122结合峰在基因区域及染色体其他区域的分布情况。（c）两个生物学重复的DAP-seq分析中，ONAC122在基因启动子区的高可信度结合峰统计结果。（d、e）被鉴定为ONAC122结合序列的CACG元件（d）和ACTC元件（e）。（f~i）电泳迁移率变动实验（EMSA）中，ONAC122、ONAC131对CACG元件（f、g）、ACTC元件（h、i）及其突变体的结合活性。将Bio标记的探针，与GST-ONAC122蛋白、GST-ONAC131蛋白或纯化的GST蛋白（作为阴性对照）共孵育，设置添加或不添加过量（20倍）非标记探针的实验组。特异性DNA-蛋白复合物与游离探针均用黑色箭头标注。（j）酵母单杂交实验（Y1H）中，ONAC122、ONAC131对CACG顺式作用元件的结合活性。将转入指定Rec2载体与pHis2载体组合的酵母细胞，经梯度稀释后，分别培养在SD/缺Trp/缺Leu、SD/缺Trp/缺Leu/缺His+30mmol/L3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）、SD/缺Trp/缺Leu/缺His+50mmol/L3-AT培养基上。（k）ACTC识别序列无法与CACG识别序列竞争结合ONAC122。将Bio标记的3×CACG探针，与GST-ONAC122蛋白或纯化的GST蛋白（作为阴性对照）共孵育，设置添加或不添加过量（20倍）非标记3×ACTC探针的实验组。特异性DNA-蛋白复合物与游离探针均用黑色箭头标注。所有实验均独立重复3次，实验结果一致。

图4. 水稻ONAC122对OsRFPH2-2和OsBIERF3启动子的结合活性及其对二者的转录激活作用。（a） 稻瘟病菌接种与未接种条件下，onac122突变体和ONAC122过表达株系中OsRLCK107、OsRFPH2-2和OsBIERF3 基因的相对表达量。对三周龄水稻植株采用叶面喷雾法，接种稻瘟病菌RB22菌株的孢子悬浮液（浓度为2×10⁵个・mL-1），并以0.05%吐温-20喷雾处理作为空白对照；在接种后指定时间点采集叶片样品进行基因表达分析，以水稻18SrRNA基因为内参完成数据标准化。实验数据以平均值±标准误表示，样本量n=9。（b、c）电泳迁移率变动实验验证ONAC122与OsRFPH2-2启动子S2位点（b）、OsBIERF3启动子S2/S3位点（c）中CACG顺式作用元件的结合作用。图中CACG元件以红色字体标注并添加下划线，（+）表示正链，（-）表示负链。将含CACG顺式作用元件的30bp片段及其突变体片段进行Bio标记，与GST-ONAC122蛋白共孵育，同时设置添加/不添加20倍过量非标记探针的实验组，以纯化的GST蛋白作为阴性对照。特异性DNA-蛋白复合物与游离探针均用黑色箭头标注。（d）经DAP-seq鉴定的OsRFPH2-2和OsBIERF3启动子中潜在的CACG顺式作用元件位点。其中P1和P2为ChIP-PCR所用探针，S1、S2、S3为启动子区域的CACG顺式作用元件位点。（e）ChIP-PCR实验验证ONAC122在体内与OsRFPH2-2和OsBIERF3启动子片段的结合作用。提取ONAC122-GFP融合蛋白表达株系的染色质片段化DNA，与GFP抗体（α-GFP）共孵育，以免疫前血清（Pre）作为阴性对照；将免疫沉淀（IP）样品、免疫沉淀前的染色质DNA（阳性对照/输入样品）用于PCR扩增检测。（f）双荧光素酶报告基因实验中所用的ONAC122、ONAC131效应载体及靶基因启动子报告载体示意图。（g、h）本氏烟草叶片中瞬时共表达ONAC122和/或ONAC131与OsRFPH2-2（g）、OsBIERF3（h）启动子后的相对荧光素酶/海肾荧光素酶（LUC/Ren）活性值。实验数据以平均值±标准误表示，样本量n=6。（i）ONAC131可提高ONAC122对含CACG元件的OsRFPH2-2和OsBIERF3启动子片段的结合亲和力。将Bio标记的探针与重组GST-ONAC122蛋白单独孵育，或与GST-ONAC122和GST-ONAC131蛋白共同孵育；特异性DNA-蛋白复合物与游离探针用黑色箭头标注，蛋白相对表达量采用IMAGEJ软件进行定量分析。注：a、g、h中不同字母表示组间差异达到显著水平（P<0.05，单因素方差分析）；所有实验均至少独立重复3次，结果一致。

图5. OsRFPH2-2 在水稻稻瘟病抗性及几丁质触发的模式触发免疫（PTI）中的正调控作用。（a）OsRFPH2-2的E3泛素连接酶活性检测。将GST融合OsRFPH2-2蛋白与人类E1、E2泛素结合酶及FLAG标签泛素在30℃条件下共孵育3小时，采用抗GST抗体和抗FLAG抗体分别检测蛋白泛素化修饰水平与蛋白表达量。（b~d）OsRFPH2-2基因敲除突变体的稻瘟病抗性显著降低。采用打孔接种法，向代表性的osrfph2-2突变体和ZH11叶片接种10 uL稻瘟病菌RB22菌株的孢子悬浮液（浓度为5×10⁵个・mL-1），观察叶片的病害症状（b）、测定病斑长度（c）并检测病菌在植株体内的相对生物量（d）。在接种后第5天记录病害表型并采集叶片样品，比例尺为0.2 cm。采用荧光定量PCR法检测病菌相对生物量，以稻瘟病菌MoPot2基因表达量相对于水稻泛素基因OsUbi的倍数表示。实验数据以平均值±标准误表示，其中c的样本量n=27，d的样本量n=9。（e）稻瘟病菌接种与未接种条件下，osrfph2-2突变体和ZH11中抗病相关基因的表达变化。对三周龄水稻植株采用叶面喷雾法接种稻瘟病菌RB22菌株的孢子悬浮液（浓度为2×10⁵个・mL-1），并以等体积0.05%吐温-20溶液喷雾处理作为阴性对照；在接种后48小时采集叶片样品进行基因表达分析，以水稻18SrRNA基因为内参完成数据标准化。实验数据以平均值±标准误表示，样本量n=9。（f、g）osrfph2-2突变体和ZH11中几丁质触发的活性氧（ROS）爆发情况（f）及OsWRKY45基因的表达变化（g）。将水稻叶圆片在清水中过夜预培养后，用浓度为100 ug・mL-1的几丁质处理，以清水处理作为阴性对照；立即检测化学发光信号，结果以相对光单位（RLU）表示（f）。在处理后指定时间点采集叶片样品进行基因表达分析，以水稻18SrRNA基因为内参完成数据标准化（g）。实验数据以平均值±标准误表示，其中f的样本量n=3，g的样本量n=9。注：c、d中**表示与ZH11相比差异极显著（P<0.01，Student's t检验）；e、g中不同字母表示组间差异显著（P<0.05，单因素方差分析）。所有实验均至少独立重复3次，结果一致。

图6. 水稻 ONAC122、ONAC131 与 OsSRWD1、OsRACK1A 及 OsRGLG2 的蛋白互作关系。（a）酵母双杂交（Y2H）实验验证ONAC122、ONAC131与OsSRWD1、OsRACK1A、OsRGLG2的互作。将含有指定重组pGBKT7载体与pGADT7载体组合的酵母菌株，分别培养在SD/缺Trp/缺Leu培养基或SD/缺Trp/缺Leu/缺His/缺腺嘌呤/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-α-gal）/金担子素A（AbA）培养基上，根据酵母菌落的生长情况判断蛋白间是否存在互作。（b）免疫共沉淀（Co-IP）实验验证ONAC122、ONAC131与OsSRWD1、OsRACK1A、OsRGLG2的互作。将携带重组pCAMBIA1300-GFP载体、pFGC1008-HA载体或空pCAMBIA1300-GFP载体的农杆菌，按指定组合共浸润至本氏烟草叶片中；浸润后48小时提取总蛋白，用GFP亲和磁珠进行3小时免疫沉淀，随后分别采用抗GFP抗体和抗HA抗体进行免疫印迹检测，目标蛋白用红色星号标注。（c）双分子荧光互补（BiFC）实验验证ONAC122、ONAC131与OsSRWD1、OsRACK1A、OsRGLG2的互作。将携带重组或空p2YN载体与p2YC载体的农杆菌，分别共浸润至表达核定位标记蛋白RFP-H2B的本氏烟草叶片中；浸润后48小时观察荧光信号，比例尺为20 um。所有实验均独立重复3次，结果一致。

图7. OsSRWD1、OsRACK1A及OsRGLG2对ONAC122转录活性的影响，以及 OsRGLG2 在水稻稻瘟病抗性和几丁质触发的模式触发免疫（PTI）中的负调控作用。（a~c）在OsRFPH2-2启动子存在的条件下，本氏烟草叶片中瞬时共表达ONAC122、ONAC131与OsSRWD1（a）、OsRACK1A（b）或OsRGLG2（c）后的相对荧光素酶/海肾荧光素酶（LUC/Ren）活性值。实验数据以平均值±标准误表示，样本量n=6。（d~f）OsRGLG2基因敲除突变体（osrglg2）的稻瘟病抗性显著增强。采用打孔接种法，向代表性的osrglg2突变体和ZH11叶片接种10 uL稻瘟病菌RB22菌株的孢子悬浮液（浓度为5×10⁵个・mL-1），观察叶片的病害症状（d）、测定病斑长度（e）并检测病菌在植株体内的相对生物量（f）。在接种后第5天记录病害表型并采集叶片样品，比例尺为0.2 cm。采用荧光定量PCR法检测病菌相对生物量，以稻瘟病菌MoPot2基因表达量相对于水稻泛素基因OsUbi的倍数表示。实验数据以平均值±标准误表示，其中e的样本量n=27，f的样本量n=9。（g）稻瘟病菌接种与未接种条件下，osrglg2突变体和ZH11中OsPBZ1基因的表达变化。对三周龄水稻植株采用叶面喷雾法接种稻瘟病菌RB22菌株的孢子悬浮液（浓度为2×10⁵个・mL-1），并以等体积0.05%吐温-20喷雾处理作为阴性对照；在接种后48小时采集叶片样品进行基因表达分析，以水稻18SrRNA基因为内参完成数据标准化。实验数据以平均值±标准误表示，样本量n=9。（h、i）osrglg2突变体和ZH11中几丁质触发的活性氧（ROS）爆发情况（h）及OsWRKY45基因的表达变化（i）。将水稻叶圆片在清水中过夜预培养后，用浓度为100 μg・mL-1的几丁质处理，以清水处理作为阴性对照；立即检测化学发光信号，结果以相对光单位（RLU）表示（h）。在处理后指定时间点采集叶片样品进行基因表达分析，以水稻18SrRNA基因为内参完成数据标准化（i）。实验数据以平均值±标准误表示，其中h的样本量n=3，i的样本量n=9。注：a~c、g、i中不同字母表示组间差异显著（P<0.05，单因素方差分析）；e、f中**表示与ZH11相比差异极显著（P<0.01，Student'st检验）。所有实验均独立重复3次，结果一致。

图8. 水稻中OsRGLG2介导的ONAC122和ONAC131泛素化修饰与降解。（a）OsRGLG2的E3泛素连接酶活性及体外对ONAC122、ONAC131的泛素化修饰。将OsRGLG2-HIS与GST-ONAC122或GST-ONAC131，在人类E1、E2泛素结合酶及FLAG标签泛素存在的条件下，于30℃共孵育3小时。采用抗HIS抗体、抗GST抗体及抗FLAG抗体分别检测蛋白泛素化修饰水平与蛋白表达量。（b）本氏烟草叶片中OsRGLG2对ONAC122、ONAC131的泛素化修饰。将携带指定重组载体（pCAMBIA1300-OsRGLG2-GFP、pFGC1008-ONAC122-HA、pFGC1008-ONAC131-HA）或空载体（pCAMBIA1300-GFP、pFGC1008-HA）的农杆菌共浸润至本氏烟草叶片；浸润后48小时提取总蛋白，用GFP亲和磁珠免疫沉淀3小时，随后采用抗HA抗体、抗GFP抗体及抗泛素抗体进行免疫印迹检测。（c、d）无细胞降解实验验证OsRGLG2介导的GST-ONAC122（c）和GST-ONAC131（d）降解。将GST-ONAC122、GST-ONAC131分别与OsRGLG2基因敲除突变体（osrglg2）和ZH11的总蛋白提取物共孵育，设置添加或不添加50μM蛋白酶体抑制剂MG132的实验组，通过抗GST抗体免疫印迹检测目标蛋白的降解情况。（e、f）本氏烟草叶片中OsRGLG2介导的ONAC122（e）和ONAC131（f）降解。将携带指定重组载体（pCAMBIA1300-OsRGLG2-GFP、pFGC1008-ONAC122-HA、pFGC1008-ONAC131-HA）的农杆菌共浸润至本氏烟草叶片，在浸润后24小时添加或不添加50μMMG132；提取总蛋白后，采用抗GFP抗体、抗HA抗体及抗Actin抗体进行免疫印迹检测。所有实验均独立重复3次，结果一致。

图9. osrglg2 onac122 双突变体稻瘟病抗性减弱及OsRGLG2-ONAC122/131-OsRFPH2-2调控水稻免疫的模式图。（a~c）osrglg2onac122双突变体的稻瘟病抗性显著减弱。采用打孔接种法，向代表性的onac122单突变体、osrglg2单突变体、osrglg2onac122双突变体及ZH11叶片接种10uL稻瘟病菌RB22菌株的孢子悬浮液（浓度为5×10⁵个・mL-1），观察叶片的病害症状（a）、测定病斑长度（b）并检测病菌在植株体内的相对生物量（c）。在接种后第5天记录病害表型并采集叶片样品，比例尺为0.2厘米。采用荧光定量PCR法检测病菌相对生物量，以稻瘟病菌MoPot2基因表达量相对于水稻泛素基因OsUbi的倍数表示。实验数据以平均值±标准误表示，其中b的样本量n=27，c的样本量n=9。b、c中不同字母表示组间差异显著（P<0.05，单因素方差分析）。所有实验均独立重复3次，结果一致。（d）OsRGLG2-ONAC122/131-OsRFPH2-2调控水稻免疫的模式图。NAC转录因子ONAC122可通过转录激活下游靶基因（包括OsRFPH2-2和OsBIERF3）的表达，正向调控水稻免疫；ONAC131可协同增强ONAC122介导的转录激活作用。ONAC122和ONAC131均能与OsSRWD1、OsRACK1A及OsRGLG2发生互作，其中OsSRWD1和OsRACK1A可增强ONAC122的转录活性，而OsRGLG2则抑制其转录活性。具有活性的E3泛素连接酶OsRGLG2可通过泛素化修饰ONAC122和ONAC131并促进二者降解，进而抑制水稻免疫。图中“促进作用"以箭头表示，代表激活或上调；“抑制作用"以钝端箭头表示，代表抑制或下调。该模式图通过BioRender软件绘制。