文献题目：A single TCP transcription factor modulates leaf size in Citrus
发表期刊：Horticultural Plant Journal
影响因子：6.2
物种：柑橘
发表时间：2026.1.21
发表单位：华中农业大学
蓝景科信提供：DAP-seq技术服务
主要研究内容
叶片是植物核心光合器官，其形态与大小直接决定光合效率和环境适应性，是关键农艺性状。TCP家族转录因子参与植物器官生长发育调控，其中CIN类TCP可抑制细胞增殖、促进叶片分化成熟，但柑橘叶片大小的分子调控机制仍不明确；GRF家族作为叶片生长的正向调控因子，其与TCP在柑橘中的协同调控机制尚未被解析。
研究表明，CsTCP2主要在柑橘叶原基中部表达，CRISPR-Cas9敲除该基因后，植株叶片显著增大，叶面积提升44.1%，该表型由细胞大小与细胞数量同步增加所致。该研究通过DAP-seq分析鉴定出CsTCP2的43439个显著结合峰，其中18.7%分布于基因启动子区，且在转录起始位点上游500bp附近高度富集，其核心结合基序为GGGNCCAC。结合RNA-seq数据分析发现，CsTCP2直接结合并调控701个下游差异表达基因，分别为563个下调基因和138个上调基因，这些基因富集于细胞分化、激素信号、细胞壁重塑及维管发育等通路，其中CsGRF5被确定为关键下游靶基因。后续实验进一步证实，CsTCP2可直接结合并抑制CsGRF5启动子，最终明确CsTCP2-CsGRF5模块是控制柑橘叶片分化成熟与大小的关键通路。
本研究阐明了柑橘中TCP转录因子调控叶片大小的分子机制，不仅丰富了木本植物叶片发育的理论体系，也为柑橘株型改良、光合效率提升和优质育种提供了关键基因靶点与重要理论支撑。
图1. CsTCP2在叶原基的中部区域表达。（A）通过RT-qPCR检测CsTCP2在不同组织中的相对表达水平。（B）通过RT-qPCR检测CsTCP2在连续发育阶段（P6~P10）叶原基中的相对表达水平。（C~K）RNA原位杂交结果显示，在卡里佐枳橙幼嫩茎尖横切面上，CsTCP2在叶原基（C~H）和刺原基（I~K）中表达。
图2. 卡里佐枳橙cstcp2突变体的叶片增大表型。（A–F）种植8个月的完整植株表型，包括野生型（WT）（A）及5个独立的cstcp2 突变株系（B–F）。（G–K）5月龄野生型（G）与cstcp2突变体（H–K）的典型叶片。（L–O）8月龄野生型（L）与cstcp2突变体（M–O）的典型叶片。（P）CRISPR-Cas9介导的卡里佐枳橙CsTCP2纯合/双等位基因突变（cr-cstcp2）。
图3. cstcp2突变体表型分析。(A–D) 5月龄野生型（WT）与cstcp2突变体顶生小叶的定量统计：叶片宽度 (A)、叶片长度 (B)、长宽比 (C)、叶面积 (D)。(E–H) 10 月龄植株叶片表皮细胞形态观察。(E) 野生型与cstcp2#3突变体铺板细胞的扫描电镜（SEM）代表性图像。(F–H) 叶片近轴面铺列细胞面积 (F)、远轴面铺列细胞面积 (G) 及气孔密度 (H) 的定量统计。(I–N) 10 月龄植株叶片解剖结构观察。(I) 野生型与cstcp2#5突变体成熟功能叶的半薄横切切片。(J–N) 海绵组织细胞面积 (J)、海绵组织细胞密度 (K)、维管束面积 (L)、木质部宽度 (M)、木质部面积 (N) 的定量统计。
图4. 柑橘中CsTCP2靶基因的全基因组鉴定。（A）YFP（对照）与YFP-CsTCP2在烟草表皮细胞中的亚细胞定位。（B）经DAP-seq鉴定的CsTCP2结合峰在基因组上的分布。（C）CsTCP2结合峰在转录起始位点上游500bp附近显著富集。（D）从CsTCP2结合峰序列中鉴定到的富集的DNA结合基序（GGGNCCAC），P值由MEME软件计算得出。（E）韦恩图展示CsTCP2结合基因（DAP-seq结果）与cstcp2突变体对比野生型的差异表达基因（RNA-seq结果）之间的重叠关系。（F-G）CsTCP2直接结合基因的GO富集分析（F）及KEGG通路富集分析（G）。
图5. CsTCP2调控叶片发育相关基因。（A）热图展示野生型与cstcp2突变体中，经DAP-seq与RNA-seq分析鉴定到的共同靶基因表达水平。（B-G）qRT-PCR验证筛选得到的CsTCP2靶基因：CsTCP2（B）、CsYAB1（C）、CsIAA14（D）、CsWOX4（E）、CsGRF5（F）、CsXTH6（G）。（H）利用纯化的GST-CsTCP2融合蛋白与羧基荧光素标记的CsGRF5启动子片段探针开展EMSA实验。（I）双荧光素酶实验所用报告载体与效应载体结构示意图。（J）不同效应因子在卡里佐枳橙叶片原生质体中对CsGRF5启动子的相对活性。
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