一、技术介绍
在生物体内，绝大多数转录因子并非单独发挥作用，而是通过与自身蛋白、其他转录因子或其他蛋白形成同源/异源二聚体/多聚体复合物来行使功能。如何挖掘这类复合物关键调控因子，对解析细胞内复杂的基因调控网络至关重要。目前，一个新技术——双DNA亲和纯化测序的（dDAP-seq）出现，为这类研究提供了新的思路和手段。双DNA亲和纯化测序（dDAP-seq）是在DNA亲和纯化测序（DAP-seq）技术基础上进化而来，其核心原理为：通过体外共表达两个带有不同亲和标签的转录因子，使其在体外形成异源二聚体，再与基因组DNA片段孵育结合，进一步富集与目的蛋白结合的DNA，经高通量测序及生物信息学分析，在全基因组范围内定位相互作用转录因子的结合位点。将dDAP-seq与DAP-seq联合应用，还可系统分析单转录因子与转录因子复合体DNA结合偏好特征与差异，为深入解析转录因子协同互作、精细绘制基因调控网络提供了全新解决方案。
蓝景科信dDAP-seq技术路线图
二、蓝景科信dDAP-seq技术验证
蓝景科信基于dDAP-seq技术已经完成多个客户项目，积累了丰富的实验数据和项目经验。近期，蓝景科信对已发表在《Nature Plants》的dDAP-seq数据[1]进行了验证，实验结果充分证明了公司自建流程的可靠性和准确性。结果显示（如下图），转录因子异源二聚体形成后，结合峰数量较单转录因子的结合峰数量显著提升，且结合基序偏好发生了改变。该结果与文献报道高度一致，且整体数据质量比文章结果更优。
图1. DAP-seq与dDAP-seq数据集中检测到的峰数量及主要基序分布
三、 dDAP-seq相关验证实验介绍
（一） 体外蛋白pull-down
在进行dDAP-seq前，首先需要体外验证两种转录因子或蛋白的直接物理互作，排除dDAP-seq结合信号的非特异性结合干扰，实验流程如下：
蛋白制备：分别纯化获得标签标记诱饵蛋白与候选互作靶蛋白；
体外孵育：将诱饵蛋白与靶蛋白体外共孵育，同时设置空载标签蛋白作为阴性对照；
亲和富集：利用亲和树脂捕获诱饵蛋白及其结合的互作蛋白，洗脱富集复合物；
蛋白检测：通过Western blot检测各组结合产物中靶蛋白表达情况。
结果判定：单一蛋白组仅存在自身条带，共孵育实验组可检测到特异性互作条带，空载对照组无特异性条带。
结果示例[2]：
图2. 蛋白pull-down实验结果。使用SBP抗体，分别对SBP-bZIPS1和Halo-bZIPC 混合后（泳道标注为Input）及经Halo标签配体偶联磁珠亲和纯化的产物（泳道标注为IP）进行检测。以Halo标签空载体作为阴性对照。WB：蛋白质印迹法；IP：免疫沉淀。
（二）凝胶迁移实验（EMSA）
该实验用于体外直接验证二聚体与靶DNA的特异性结合，并区分单体与复合物条带，实验流程如下：
探针制备：合成并标记包含dDAP-seq鉴定的结合位点的DNA探针；
蛋白孵育：分别制备单转录因子蛋白、两种转录因子混合蛋白，与标记探针体外孵育；
凝胶电泳：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离游离探针与蛋白–DNA复合物；
结果判定：单转录因子组出现较快迁移条带（单体结合），双转录因子共表达组出现更慢迁移条带（异源二聚体结合），条带位置与单体组明显区分；
结果示例：
图3. EMSA实验结果。Lane1：转录因子1+阳性探针；Lane2：转录因子2+阳性探针；Lane3：转录因子1和转录因子2复合体+阳性探针。
（三）双荧光素酶报告基因验证（Dual-LUC）
用于体内验证转录因子复合物对靶基因的转录调控活性，量化协同调控效应，实验流程如下：
报告载体构建：将dDAP-seq鉴定的靶基因启动子区插入荧光素酶报告载体；
效应载体共转染：将两个转录因子表达载体与报告载体、内参载体共转染细胞；
分组设置：设置空载体对照、单转录因子组、双转录因子共转组；
荧光检测：检测萤火虫/海肾荧光素酶活性，计算相对活性
结果判定：双因子共转组活性显著高于/低于单因子组，证明转录因子复合物协同激活/抑制靶基因转录。
结果示例：
图4. 双荧光素酶报告基因验证实验结果。EV+EV+EV：空载+空载+空载；EV+a+EV：空载+靶基因启动子+空载；TF1+a+EV：转录因子1+靶基因启动子+空载；TF2+a+EV：转录因子2+靶基因启动子+空载；TF1+a+TF2：转录因子1+靶基因启动子+转录因子2。
蓝景科信：转录调控研究的合作伙伴
蓝景科信深耕功能基因组学领域，累计完成260+物种，4000+转录因子的实验项目，凭借高质量的服务，已助力合作客户在Cell，Science，Molecular Plant，Plant Biotechnology Journal，Journal of Advanced Research，Plant Cell，PNAS等数十期刊发表高质量研究成果。
蓝景科信核心服务体系涵盖DAP-seq、dDAP-seq及ChIP-seq等组学技术，同时配套EMSA、Dual-LUC、Y1H、ChIP-qPCR等下游验证方案，并提供蛋白Pull-down、Y2H、Co-IP等全套蛋白互作服务。打造“组学检测—功能验证—互作分析"一站式转录因子研究解决方案，支撑科研工作高效推进！
参考文献
[1] Galli M, Chen Z, Ghandour T, et al. Transcription factor binding divergence drives transcriptional and phenotypic variation in maize. Nat Plants. 2025;11(6):1205-1219. doi:10.1038/s41477-025-02007-8
[2] Li M, Yao T, Lin W, et al. Double DAP-seq uncovered synergistic DNA binding of interacting bZIP transcription factors. Nat Commun. 2023;14(1):2600. Published 2023 May 5. doi:10.1038/s41467-023-38096-2
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