【中文题目】小鼠棕色和白色脂肪细胞翻译图谱分析，鉴定代谢相关的小开放阅读框和功能性微蛋白
【文章题目】Profiling Mouse Brown and White Adipocytes to Identify Metabolically Relevant Small ORFs and Functional Microproteins
【发表期刊】Cell Metabolism（Q1，IF 27.7）
【发表年份】2023年
【研究团队】美国西雅图诺和诺德研究中心Christopher A. Barnes团队和美国索尔克生物研究所Alan Saghatelian团队共同合作
【研究技术】核糖体印迹测序（Ribo-Seq）和蛋白质组学（DIA-MS）组合
【研究概要】本文利用Ribo-Seq分析了小鼠棕色、白色和米色脂肪细胞中的短开放阅读框（smORFs）和微蛋白（MPs），鉴定到未注释的、具有MP编码潜力的smORF 共3877个。通过蛋白质组学验证，其中85个MP被确认具有功能性，包括33个在血浆中循环的MP。进一步分析发现，许多MP在高脂饮食等生理条件下受到调节，并与已知的代谢基因呈现共表达。此外，Ribo-Seq 还提供了 Gm8773 翻译的证据，该基因编码一种与人类和鸡FAM237B同源的分泌微蛋白。Gm8773 在下丘脑弓状核中高度表达，向肥胖小鼠脑室内注射重组mFAM237B会引起食欲增加。这表明脂肪细胞MP数据库对于研究参与基本代谢和生理过程的代谢调节因子具有重要价值。
近年来，随着核糖体图谱分析和质谱技术的快速发展，越来越多的微蛋白被鉴定出来，这不仅拓展了人们对蛋白质的理解，也为生命科学研究开辟了一个新方向。研究证明，许多微蛋白在细胞应激、肌肉发育和代谢调控中发挥重要作用，然而，微蛋白的鉴定以及功能研究还有待深入发掘。脂肪组织不仅是能量储存器官，还是一种内分泌器官，能够分泌多种代谢调节因子（如瘦素、脂联素）以调节摄食、能量平衡和产热。许多的微蛋白具有代谢调节功能，这提示微蛋白可能是代谢调节剂的丰富来源。肥胖和代谢疾病的高发，使得挖掘新的代谢调控因子尤为重要。
研究结果
1.采用Ribo-seq技术鉴定小鼠脂肪细胞中新型微蛋白编码基因
为排除脂肪组织中多种细胞类型的干扰，本研究采用原代小鼠棕色、白色和米色脂肪细胞，通过Ribo-Seq技术鉴定出3,877个未被注释的小开放阅读框。其中，246个在三种脂肪细胞中共同表达，926个在至少两种细胞中表达。这些smORF的长度分布和氨基酸使用频率与人类细胞中观察到的微蛋白特征高度一致。
smORF分类：包括5’ UTR中的上游ORF（1,816个）、3’ UTR中的下游ORF（568个）、内含子区域（947个）及非编码RNA/基因间区域（536个）。uORFs可能调控下游主开放阅读框的翻译，如代谢相关基因（如Insr、Igf1、Cd36、Ucp1等）中的uORFs，进一步分析发现这些含uORF的基因显著富集于脂质代谢、线粒体组织等代谢相关通路。微蛋白分类：预测含有跨膜结构域的MP有84个，具有信号肽的分泌型MP有183个，其中27个同时具备两种特征。进化保守性：204个smORF在哺乳动物中高度保守，273个小鼠smORF与人类具有高度序列相似性，提示其潜在功能的重要性。组织分布：122个含smORF的转录本在脂肪组织中特异性表达，提示其在脂肪生物学中可能发挥重要作用。
图1. Ribo-seq鉴定脂肪组织中的smORF和MP
2.蛋白质组学验证微蛋白表达
采用DIA-MS和DDA-MS联合策略，在原代脂肪细胞裂解液及条件培养基中验证了多个微蛋白的表达。其中，Gm14023-MP和CELF2-MP在棕色与白色脂肪细胞间存在显著差异。该方法为短肽的精准定量提供了高灵敏度的工作流程。
图2. DIA-MS工作流程
3.小鼠和人类mRNA中的uORF启示
Pten是一个已知的肿瘤抑制因子，可促进BAT中的Ucp1表达升高，在小鼠中的高表达可改善脂肪组织代谢和整体代谢健康。小鼠与人类Pten基因均含有保守的uORF，可编码一个由45个氨基酸组成的MP，提示其可能兼具翻译调控与独立功能。
PPAR-δ是一种重要的核受体，在维持能量平衡方面具有广泛的作用，而Ppar-δ基因敲除小鼠的代谢活性较低，葡萄糖不耐受。小鼠与人类PPAR-δ基因都含有uORF，虽然序列不保守，但均被翻译，提示uORF本身的存在而非编码序列可能是翻译调控的关键。
总之，Pten和Ppar-δ基因均含有功能性uORF，且可翻译成微蛋白的例子，为进一步研究uORF和MP功能提供了有趣的启发。
图3. 肥胖小鼠模型中smORF表达呈显著差异
4.肥胖小鼠模型中smORF表达显著改变
在高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型中，多个脂肪组织中的smORF表达发生显著变化，并与脂代谢、线粒体功能等通路相关。PCA分析显示，smORF表达谱可有效区分不同脂肪组织类型及代谢状态。共表达网络分析进一步揭示，多个smORF与代谢关键基因（如Lpl、Adipoq、Ghr）协同表达，提示其可能参与能量代谢调控、胰岛素敏感性、能量平衡等生理过程。
图4. 脂肪中的smORFs与代谢相关基因呈现共表达
5.在血浆中检测到循环的微蛋白
通过DIA-MS分析不同月龄肥胖与瘦鼠的血浆蛋白质组，共检测到33个循环微蛋白。其中，AW112010-MP被证实为循环因子，FRS2 uORF-MP在老年肥胖小鼠血浆中显著上调，提示其可能作为代谢相关生物标志物。
图5. 老年肥胖小鼠血浆蛋白质组学分析
6.Gm8773编码促食欲的神经分泌微蛋白FAM237B
Ribo-Seq证实Gm8773在脂肪细胞中翻译，编码一个由132个氨基酸组成的分泌型微蛋白，与鸡和人的FAM237B同源（神经分泌蛋白GM，简写NPGM）。原位杂交显示其在下丘脑弓状核高表达，并与NPY神经元共定位（促食欲神经元）。脑室内注射重组mFAM237B可显著促进肥胖小鼠摄食，揭示了Gm8773作为促食欲因子在摄食调控中的作用。
图6. 小鼠中微蛋白Gm8773的表达、定位和功能验证
研究小结
本研究通过多组学策略鉴定了小鼠脂肪细胞中大量未被注释的smORF及其编码的微蛋白，揭示了其在代谢调控中的潜在重要功能。特别是Gm8773/FAM237B的发现，为摄食行为的神经调控提供了新的分子靶点。然而，该研究还存在一些局限性，例如：质谱对短肽检测灵敏度有限，大量预测的微蛋白尚未被验证；大多数微蛋白的生物学功能仍需通过基因敲除或过表达等实验进一步验证；Gm8773的促食欲作用目前仅基于药理学实验，其生理功能尚需遗传学模型确认。
研究意义
1.建立了一套适用于短肽鉴定的高灵敏度Ribo-Seq + DIA-MS联合策略；
2.提供了小鼠脂肪细胞smORF和微蛋白的全面数据库，为后续功能研究奠定基础；
3.揭示代谢相关基因中uORF的翻译调控新机制；
4.新发现的微蛋白可作为代谢调节因子或生物标志物，为肥胖和糖尿病治疗提供新靶点。
参考文献：Martinez TF, Lyons-Abbott S, Bookout AL, De Souza EV, Donaldson C, Vaughan JM, Lau C, Abramov A, Baquero AF, Baquero K, Friedrich D, Huard J, Davis R, Kim B, Koch T, Mercer AJ, Misquith A, Murray SA, Perry S, Pino LK, Sanford C, Simon A, Zhang Y, Zipp G, Bizarro CV, Shokhirev MN, Whittle AJ, Searle BC, MacCoss MJ, Saghatelian A, Barnes CA. Profiling mouse brown and white adipocytes to identify metabolically relevant small ORFs and functional microproteins. Cell Metab. 2023 Jan 3;35(1):166-183.e11.
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