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蓝景科信DAP-SEQ(DNA亲和纯化测序)技术服务常见问题

发布时间:2021-03-22   点击次数:682次

DAP-SEQ技术简介
DAP-SEQ是基于DNA亲和纯化,通过体外表达转录因子鉴定TFBS的技术,具有不受抗体和物种限制,且高通量的优势,自该技术问世以来,已被广泛应用于转录调控和表观组学的研究。

那么关于DAP-SEQ都有哪些问题需要关注呢?

1. DAP-seq原理、技术流程,能解决什么样的问题?
原理:体外表达的蛋白和DNA进行亲和纯化,将与蛋白结合的DNA洗脱后进行高通量测序。
技术流程:将编码转录因子的CDS序列构建到含有亲和标签的载体中,构建蛋白表达载体,进行体外蛋白表达,形成转录因子和亲和标签的融合蛋白;提取样品的基因组DNA,构建DNA文库,然后将体外表达的带有亲和标签的转录因子和DNA文库进行结合,随后把结合的DNA洗脱后上机测序。
能帮助您快速找到转录因子的结合位点,寻找转录因子调控的靶基因。

服务流程:

DAP-SEQ实验流程
 

2. 需要提供什么材料?
需要您提供:
(1)组织材料或者是提取好的基因组DNA;
(2)含有转录因子CDS序列的质粒。

3. 分析结果包括哪些内容?
蓝景科信DAP-seq的生信分析包括以下内容:
1.对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量 reads 的处理
2.数据产出统计
3.参考序列比对分析
4.测序reads富集区域扫描(peak calling)
5.Peak长度分布统计
6.Peak在基因功能元件上的分布统计
7.Peak序列模式发掘(motif search)
8.已知motif注释
9.Peak相关基因鉴定
10.Peak相关基因的GO和KEGG富集分析
11.测序数据的差异分析(>=2个样本)
12.测序数据的可视化分析

4.实验的成功率怎么样?
不同转录因子家族的成功率不同,请参考不同转录因子家族的DAP-seq成功率:

在这里插入图片描述
5. 为什么有些基因家族的成功率很低?
有些转录因子需要和其他蛋白形成复合体才能与DNA结合,这些蛋白的风险比较高。

6. 一些特殊的样品能不能做,有没有风险?
有两种情况的样品是不能做DAP-seq 实验的,一种情况是没有参考基因组,另一种情况是转录因子不能在体外表达出来,除此之外,我们会做可行性分析报告供您参考。

7. 包含重复吗?
包含两个技术重复。

8. 做这个蛋白表达的时候,使用的什么表达系统?
优先使用真核表达系统进行蛋白表达,如果真核表达系统不能表达成功的话可以沟通换用原核表达系统。

9. 植物组织样本取样的时期部位有什么要求?
植物组织样本取样的时期和部位是您根据自己的研究需求确定,不同组织和时期DNA的修饰不同,可能会影响蛋白和DNA的结合。

10. DAP-seq跟ChIP-seq有何区别,DAP-seq的优势表现在哪里?
DAP-seq和ChIP-seq的区别:

在这里插入图片描述

DAP-seq的优势:不需要针对每个转录因子制备特异性抗体,快速、高通量、节约时间成本。

11. DAP-seq用的input是什么,为什么选这个作为对照呢?
Input对照是用的亲和纯化前的文库,目的是降低背景噪音,我们用的Input和2016年发表在Cell(DAP Seq-Cistrome and Epicistrome Features Shape the Regulatory DNA Landscape)上的论文是一致的。

12. 为什么实验中表达的有些蛋白比理论值偏大?
很多蛋白表达出来比理论值大一些,因为有一些翻译后修饰,很多情况都是这样的,原核表达也有这类情况,比如拟南芥SnRK蛋白激酶,预测40 kd,通过原核表达,实际分子量是60 kd。

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