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蓝景科信DAP-seq(DNA亲和纯化测序)实验流程

发布时间:2021-04-01   点击次数:1055次
一、蛋白表达载体构建
1.1. 蛋白表达载体构建试剂
高保真PCR预混液,琼脂糖凝胶回收试剂盒,同源重组克隆试剂盒,DH5α感受态细胞,高纯度质粒小提试剂盒。
1.2. 蛋白表达载体构建方法
1.2.1. 根据基因CDS序列,设计上游和下游引物并进行引物合成。
1.2.2. 使用高纯度质粒小提试剂盒提取含有CDS序列的质粒模板,或者使用客户提供的质粒模板,对目的CDS进行PCR扩增。

 

1.2.3. PCR反应程序

 
1.2.4. PCR产物回收
PCR结束后,进行琼脂糖凝胶电泳。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒,对目的条带进行胶回收。PCR产物回收后,测定回收产物的浓度,并进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.5. PCR产物与蛋白表达载体的连接转化与鉴定
使用同源重组方法,将目的片段与蛋白表达载体进行连接。将连接产物转化到DH5α感受态细胞中,涂布于含有抗生素的LB培养基上,倒置培养。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定,对扩增出目的条带的菌落进行质粒提取与测序。将测序结果与CDS进行序列比对。
1.2.6. 蛋白表达载体的质粒提取
对构建正确的蛋白表达载体,进行质粒的提取,为后续蛋白表达做准备。 
 
二、基因组DNA的提取
2.1. 基因组DNA提取试剂
根据不同物种、组织和器官,使用相应的提取试剂或者试剂盒。例如:CTAB提取试剂盒、植物通用型提取试剂盒、磁珠法提取试剂盒、含多糖多酚样本的基因组DNA提取试剂盒。
2.2. 基因组DNA提取方法
2.2.1. 称取适量样本材料,液氮速冻,研磨成粉末,使用相应的试剂盒进行基因组DNA提取。
2.2.2. 对提取的基因组DNA的质量进行检测,包括基因组DNA浓度,纯度,电泳。
 
三、亲和纯化文库构建
3.1. 亲和纯化文库构建试剂
3.1.1. DNA建库试剂盒(BIOO SCIENTIFIC,NOVA-5188-01-NEXTflex-Rapid-DNA-Seq-kit-2.0)。
3.1.2. DNA Clean Beads (MICH Scientific,货号NGS-0201-100)
3.2. 亲和纯化文库构建方法
3.2.1. 取适量基因组DNA进行片段化。
3.2.2. 对片段化后的基因组DNA进行筛选。
3.2.3. 取适量片段筛选后的基因组DNA进行亲和纯化文库的构建,具体方法详见NOVA-5188-01-NEXTflex-Rapid-DNA-Seq-kit-2.0建库试剂盒说明书(BIOO SCIENTIFIC)。
3.2.4. 文库构建结束后进行质检。
 
 
四、体外无细胞蛋白表达与检测
4.1. 体外无细胞蛋白表达的主要试剂

4.1.1. 无细胞蛋白表达试剂盒
4.1.2. 用于进行Western Blot检测的一抗和二抗。
4.2. 体外无细胞蛋白表达反应方法
根据无细胞蛋白表达试剂盒的使用说明,建立以下反应体系,然后25 °C孵育2 h。
 
 
4.3. 体外蛋白表达检测
4.3.1. 体外蛋白表达结束后,取适量反应液,进行SDS PAGE和Western Blot,检测有无目标蛋白的特异性条带。
 
五、蛋白质与文库的亲和纯化
5.1. 亲和纯化所需要的主要试剂和设备
5.1.1. 亲和纯化磁珠
5.1.2. 平衡缓冲液
5.1.3. 24孔磁力架(Mich Scientific,货号Magpow-24)
5.2. 亲和纯化方法
5.2.1. 将平衡好的磁珠与平衡缓冲液混匀。
5.2.2. 将蛋白表达预混液与磁珠充分混匀后进行孵育。
5.2.3. 向上述混合液中加入适量文库后充分混匀后进行孵育。
5.2.4. 洗涤非特异性结合DNA,洗脱特异性结合的DNA。
 
六、洗脱文库扩增质检与测序

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