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DAP-seq新技术助力转录因子研究

发布时间:2021-04-08   点击次数:1048次

一、DAP-Seq(DNA亲和纯化测序)技术问世

 

2016年5月,来自美国Salk研究所的科学家们在Cell期刊发表题为“Cistrome and Epicistrome Features Shape the Regulatory DNA Landscape”的文章(IF=28.71)。该研究开发了一项新技术:DAP-Seq(DNA亲和纯化测序),用于快速绘制转录因子调控靶向DNA区域的图谱:顺反组(cistrome)的蛋白质结合区域的景观图。构建完整的顺反组和表观组图谱(epicistrome maps)是阐明生长发育、行为和疾病复杂转录调控网络的重要方法。DAP-seq大大扩展了科学家们收集的关于转录因子及它们结合位点的信息。

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DAP-Seq将蛋白质体外表达技术与高通量测序技术相结合,不需要针对每个转录因子制备特异性抗体,所以DAP-Seq具有快速、高通量、节约时间成本等显著优势,比Chip-seq更易于扩展;DAP-Seq方法可用于所有的植物,这为科学家提供了一扇窗口,了解调控序列中的遗传或表观遗传变异影响它们性状的机制。

本研究为了检验DAP-Seq技术,科学家们快速绘制出了529种转录因子结合拟南芥基因组的位点。鉴别出了270万个结合位点。随后采用包含或不包含胞嘧啶甲基化的DNA重复了这些实验。该文测试的大约四分之三的转录因子结合模式发生了改变。这使得科学家们能够揭示出如果不除去甲基化,或许会漏掉的结合位点。采用这些方法,可以看到只在一部分细胞或组织中活化的结合位点。该研究不仅阐明了调控蛋白改变基因表达的机制,还揭示了表观遗传甲基化标记在这种调控中所起的作用。

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Figure 1. Genome-wide Discovery by DAP-Seq

 

二、DAP-Seq(DNA亲和纯化测序)技术完善

 

2017年 8月,同样是 Salk研究所的科学家们,在Nature Protocols期刊发表题为“Mapping genome-wide transcription factor 结合位点 using DAP-seq”的文章(IF=12.423)。详细叙述了运用DAP-Seq(DNA亲和纯化测序)技术对全基因组转录因子结合位点的检测实验和整体流程。一个有分子生物学经验的研究人员遵循这个方案,每周可处理多达400个样本。

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研究材料:5 μg genomic DNA,本文作者已采用DAP-seq技术,成功对拟南芥、玉米15号和人类(未发表)转录因子进行了检测。

研究方法:DAP-seq

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Figure 2. DAP-seq protocol overview

 

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Figure 3. 拟南芥转录因子  TGA5 (AT5G06960) DAP-seq DNA 文库检测实验

 

三、DAP-Seq(DNA亲和纯化测序)技术在中国的运用

 

2019年8月21日,来自广州大学生命科学学院董志诚、宁丽华和江苏省农业生物学重点实验室赵涵等,在Chinese Science Bulletin杂志发表题为“Mapping genome-wide 结合位点 of endosperm specific expression transcription factor O2 using DAP-Seq”的文章。利用DAP-Seq(DNA亲和纯化测序)技术,通过DNA建库(NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit(Bioo Scientific)),鉴定玉米胚乳特异表达转录因子O2在全基因组水平上的结合位点。该研究共检测到317个O2直接结合并调控的靶标基因,包括97个已报道的ChIP-Seq检测到的靶基因,以及220个DAP-Seq特异检测到的靶基因。

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研究材料:授粉后15 d的B73玉米胚乳。

研究方法:DAP-seq :NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit(Bioo Scientific)进行DNA文库构建;蛋白表达;DNA与蛋白结合以及Western-blotting检测;测序并进行数据分析。

经基序(motif)富集分析显示,DAP-Seq检测O2结合317靶标基因与220个特异结合靶标基因所富集的基序均与已报道O2结合motif相同。另外,GO富集分析显示,与ChIP-Seq一致的O2靶基因主要参与zein蛋白合成及氨基酸代谢途径,而特异检测的O2靶标基因,除参与上述途径外,还主要参与糖代谢途径以及多个胁迫响应相关途径。本研究利用DAP-Seq技术进一步揭示了O2在胚乳发育过程发挥调控作用,该结果是对前人研究结果的验证和补充。

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