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介绍酵母单杂交的基本操作过程

发布时间:2022-04-24   点击次数:177次
  酵母单杂交(Yeastone-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理,克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。其理论基础是:许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-bindingdomainBD)和转录激活区(ActivationdomainAD)组成,因此可构建各种基因与AD的融合表达载体,在酵母中表达为融合蛋白时,根据报道基因的表达情况,便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上,在单杂交检测中,任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。
  酵母单杂交的基本操作过程:
  (1)设计含目的基因(称为诱饵)和下游报告基因的质粒,并将其转入酵母细胞。
  (2)将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒转化人同一酵母中。
  (3)若文库蛋白与目的基因相互作用,可通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来。在这里作为诱饵的目的基因就是启动子DNA片段,文库基因所编码的蛋白就是启动子基因结合蛋白。
  迄今为止,应用酵母单杂交体系已经识别并验证了许多与目的DNA序列结合的蛋白质,同时单杂交技术还被应用于识别金属反应结合因子。正向与反向单杂交体系的结合,还可用于筛选阻碍DNA与蛋白质相互作用的突变的单个核苷酸。
  目前,在研究DNA—蛋白质相互作用中,酵母单杂交体系主要有以下3种用途:①确定已知DNA—蛋白质之间是否存在相互作用;②分离结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因;③定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域,以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。

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