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介绍原核蛋白表达过程中常见的问题

发布时间:2022-07-20   点击次数:32次
  原核表达是指通过基因克隆技术,将外源目的基因,通过构建表达载体并导入表达菌株的方法,使其在特定原核生物或细胞内表达。原核蛋白表达系统是目前常用、经济的蛋白表达方法。大肠杆菌表达系统是应用广泛的原核蛋白表达系统之一。
  一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株。如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂,融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑,比如表达量高低,目标蛋白的活性,表达产物的纯化方法等等。下面介绍下原核表达过程中常见问题。
  1、为什么目的蛋白总是以包涵体形式出现?
  在原核表达纯化中目的蛋白经常发生错误折叠,并聚集成为包涵体。经过诱导后目的蛋白表达通常可达细胞总蛋白的50%以上,虽然有一定比例的蛋白以可溶形式存在,多达95%的蛋白则存在于包涵体。为了获得更多可溶蛋白,在实验过程中,可以降低诱导温度,例如16-30℃,或降低IPTG浓度(0.01-0.1mM)并延长诱导时间,还可以采用特别的培养基培养细菌。
  2、跨膜蛋白为什么很难表达?
  跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个常见问题,主要原因可能有两个:
  1.跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式链接,形成的亲水疏水的一个简单的跨膜化学结构,这种结构和信号肽结构形似。而对于原核细胞来说,简单的细胞器很难像真核细胞一样完成信号肽的识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程,有些蛋白多次跨膜,对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。
  2.对于疏水性片段,在原核细胞表达中非常容易形成包涵体,疏水性多肽会抑制翻译过程,甚至与原核膜结构融合形成毒性,处于生物自我保护的本能,所有细胞器都会停止合成蛋白的过程。

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