DAP-seq技术在bHLH-zip转录因子调控灵芝代谢研究中的应用

灵芝酸（GAs）是一种三萜类化合物，是灵芝属中的关键药理活性化合物，具有多种生物学功能。然而，直接调控GA生物合成的转录因子仍然知之甚少。

该研究首先采用Illumina和PacBio测序策略对灵芝菌株的基因组进行了从头测序和组装，随后进行了基因功能分析，并注释了参与三萜类化合物和麦角甾醇生物合成的基因。然后，通过多个物种的基因保守性比对分析，筛选到了调控三萜生物合成的潜在bHLH-zip转录因子甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）。

图1. 在全基因组水平上鉴定SREBP的结合位点和基序

通过DAP-seq分析，在全基因组水平鉴定了转录因子SREBP的结合位点和靶基因。进一步对这些靶基因进行KEGG富集分析，发现包括三萜类化合物合成和脂质代谢相关途径富集。电泳迁移实验（EMSA）进一步验证了SREBP与靶基因之间的相互作用。

图2. RNA-seq分析显示了SREBP调控灵芝三萜类、麦角甾醇和脂质生物合成基因的表达

通过RNA-seq与DAP-seq联合分析，发现SREBP靶基因之中，参与类固醇和三萜类生物合成的甲羟戊酸激酶（g3941）和3-羟基-3-甲基戊二酰合成酶（g1941），以及参与麦角甾醇生物合成的甾醇异构酶（ERG2，g7787）和羊毛甾醇14-脱甲基酶（ERG11，g3908），在SREBP过表达菌株（OEP::SREBP）中显著上调表达。此外，参与甘油磷脂/甘油脂代谢的3个靶基因，乙醇胺-磷酸转移酶（g1208）、溶血磷脂酰基转移酶（g4309）和心磷脂特异性磷脂酶（g4280）也显著上调表达。次级代谢组学和脂质代谢组学分析发现，甲羟戊酸、羊毛甾醇、麦角甾醇和13种不同的GA以及多种脂质的含量在该SREBP过表达菌株中显著增加。此外，当OE::SREBP菌株用外源性SREBP特异性抑制剂fatostatin处理时，SREBP过表达对三萜类化合物和脂质代谢的影响得以恢复。以上RNA-seq、次级代谢组学和脂质代谢组学的分析，揭示了SREBP的过表达通过促进GA、麦角甾醇和脂质生物合成相关靶基因的转录，导致GA、麦角甾醇和脂质代谢显著增加。

图3. SREBP调节灵芝GA、麦角甾醇和脂质生物合成的机制图

总之，该研究在灵芝基因组中发现了一个bHLH-zip转录因子SREBP。DAP-seq鉴定了DNA序列5′-GRVGRVGRVGR-3′为最佳的SREBP结合基序，以及参与GA、麦角甾醇和脂质生物合成的关键靶基因。SREBP过表达菌株的进一步实验研究阐明了SREBP在灵芝三萜类化合物和脂质代谢中的作用及其调控机制。

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