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Tn5转座酶的作用原理及操作步骤

更新时间:2023-03-13   点击次数:2325次
  Tn5转座酶是一种DNA转座酶,能够嵌入和剪切基因组DNA,引起基因组的突变和多样性。它广泛应用于基因组编辑、基因表达调控等领域。以下将从作用、原理和操作方法三个方面对Tn5转座酶进行介绍。
  一、作用
  Tn5转座酶的作用是将DNA插入到细胞的基因组中,从而引起基因突变或重组,促进细胞基因的多样化。它可以通过DNA插入或剪切相邻的目标DNA分子,形成突变基因或新的DNA序列组合。这种酶的作用过程很快,插入时间仅需几分钟,插入效率很高,特别适合用于快速分析和构建大型基因库。
  二、原理
  Tn5转座酶的作用原理主要与其自身的结构和功能密切相关。该酶通过结合转座子两端的反向重复序列,并选择性地识别靶点DNA上的ATRich序列,使其嵌入DNA单链,从而引起DNA序列的转移和突变。具体的,Tn5转座子先与DNA发生稳定结合,然后结合一些辅助蛋白,切断DNA双螺旋,同时将转座子移动到目标靶点位置形成新序列,最终将DNA缩短,在脱离后又可能结合形成真正的复合体,反复进行嵌入和剪切等反应,导致目标DNA突变并创建新的DNA序列组合。
  三、操作方法
  Tn5转座酶的操作方法主要包括DNA制备和转座子的引入。DNA制备是指将需要操作的DNA基因片段制备好,通常使用PCR扩增法制备目标DNA;转座子的引入是指将Tn5转座子引入到DNA分子中,这可以通过一个简单的化学转化反应来完成。具体步骤如下:
  1.DNA制备:使用PCR扩增目标DNA,将扩增产物分离出来,纯化后,补碳/尾巴。
  2.Tn5转座子酶的引入:将Tn5转座子DNA与转座酶共同作用,形成酶-转座子DNA复合体,移植到DNA基因上。
  3.体外反应过程:将DNA和酶向体外反应,使酶能与受体形成复合物,形成突变。