DAP-seq在毛白杨PtoWRKY68等位基因调控干旱胁迫响应机制中的应用

干旱胁迫限制了树木的生长，并影响其地域性分布。为了应对干旱胁迫，植物进化出了一系列的生理生化反应机制，以保护植物细胞免受损害。因此，研究干旱胁迫下树木生理和光合作用变化的分子机制，将有助于培育耐旱性树木新品种，增强林木的生产力和经济价值。

2023年5月29日，北京林业大学生物学院林木分子育种团队的研究成果，发表在学术期刊Plant Physiology，文章题目为 “Allelic variation in transcription factor PtoWRKY68 contributes to drought tolerance in Populus"。该期刊的影响因子为8.005。该研究使用DNA亲和纯化测序(DAP-seq) 技术鉴定了毛白杨转录因子PtoWRKY68的结合基序以及靶基因。揭示了PtoWRKY68基因等位变异通过调控ABA信号通路响应干旱胁迫的分子机制，为利用分子育种策略开发耐旱树木新品种奠定了遗传基础。

该研究利用来自不同自然种群的300份中国白杨材料，对7个干旱相关性状进行全基因组关联分析（GWAS）。与充足水分条件下相比，在干旱条件下植物的水分利用效率（WUE）、ABA水平、脯'氨酸水平（PRO）均显著提高，气孔导度（Gs）、细胞间CO₂浓度（Ci）、蒸腾速率（Tr）、叶绿素含量（Chl）则显著下降。在干旱条件下，中国西北（NW）和东北（NE）气候区域的干旱相关性状变化率明显高于南部（S）地区。在全基因组水平上，筛选到显著相关的一个SNP位点，位于Ptom.004G.01096起始密码子上游1.9Kb（与Gs显著相关），该基因编码WRKY家族转录因子PtoWRKY68。干旱胁迫下PtoWRKY68的表达水平显著增加，说明PtoWRKY68可能参与了毛白杨的干旱胁迫响应过程。过表达PtoWRKY68提高了转基因拟南芥（OE-1和OE-3）的耐旱性，这表明PtoWRKY68是一个植物耐旱性的正调控因子。

图1. 毛白杨干旱相关性状的全基因组关联分析

PtoWRKY68基因序列变异分析，发现WRKY结构域上游的一个12bp indel和WRKY结构域中的三个非同义变异与Gs显著相关。基于PtoWRKY68基因变异，将毛白杨分为两个单倍型类群：PtoWRKY68^hap1（已在拟南芥中做了过表达）和PtoWRKY68^hap2。等位基因频率调查显示PtoWRKY68^hap1主要分布在NE和NW区域，PtoWRKY68^hap2主要分布在S区域，这与当地降水的趋势相一致，符合杨树的地理适应特征。分析还发现PtoWRKY68^hap1材料对干旱的响应明显高于PtoWRKY68^hap2材料。然而，在干旱胁迫下PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2的上调表达水平相当，所以两个单倍型群体对干旱胁迫响应的差异并不是由于PtoWRKY68等位基因表达水平的差异所致。在干旱胁迫下，PtoWRKY68^hap1OE的耐旱性强于过表达PtoWRKY68^hap2的转基因拟南芥植株（PtoWRKY68^hap2OE），且二者都强于WT。此外，与WT和PtoWRKY68^hap2OE相比，PtoWRKY68^hap1OE中WUE、ABA、PRO的值更高，Gs和Tr的值更低。以上结果表明PtoWRKY68^hap1对毛白杨耐旱性的进一步提高，可能与等位基因变异对干旱胁迫的不同响应有关，其中PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2分别为耐旱等位基因和干旱敏感等位基因。

图2. PtoWRKY68等位基因变异与毛白杨耐旱性显著相关

随后，对充足水分和干旱胁迫条件下的差异表达基因（DEGs）进行共表达网络分析。干旱胁迫下在PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2两个单倍型群体之间有164个基因的表达存在显著差异，说明这些基因的表达受到PtoWRKY68等位基因变异的影响。采用DAP-seq技术分别鉴定了PtoWRKY68^hap1和PtoWRKY68^hap2的核心结合基序W1-box和W2-box及其靶点。KEGG分析发现靶基因主要富集于防御反应和植物激素信号通路中。基于DEGs、共表达网络分析和DAP-seq分析，筛选到3个与PtoWRKY68等位基因相关的靶基因：PtoABF2.1、PtoRD26.1、PtoDTX49.1。干旱胁迫下与在PtoWRKY68^hap2材料中相比，在PtoWRKY68^hap1材料中PtoABF2.1和PtoRD26.1的表达量更高，而PtoDTX49.1的表达量更低。因此表明，PtoWRKY68介导了PtoDTX49.1、PtoABF2.1和PtoRD26.1在干旱胁迫下的转录调控。

图3. DAP-seq鉴定PtoWRKY68等位基因潜在的靶基因

基于DAP-seq数据中的结合峰值、荧光素酶报告实验(DLRA)、凝胶阻滞实验（EMSA），说明了与PtoWRKY68^hap2相比，PtoWRKY68^hap1对靶基因的启动子具有更高的亲和力。干旱胁迫下与WT和PtoWRKY68^hap2OE相比，在PtoWRKY68^hap1OE中AtABF2和AtRD26的表达水平显著升高，AtDTX50的表达水平则明显降低。ABA敏感性实验说明PtoWRKY68等位基因在ABA依赖的气孔关闭中起重要作用。随后还发现与PtoWRKY68^hap2材料相比，PtoWRKY68^hap1材料的失水速度较慢、气孔关闭速度较快。因此，干旱胁迫下PtoWRKY68^hap1通过增强干旱胁迫信号通路和ABA信号通路以及减少ABA外排，从而增加细胞中的ABA积累，最终增强植物的耐旱性。

图4. PtoWRKY68等位基因直接结合靶基因的启动子并调控其转录活性

数量性状位点（eQTL）分析发现PtoSVP.3受干旱胁迫诱导表达，其表达水平与PtoWRKY68呈正相关。EMSA和DLRA实验验证了PtoSVP.3与PtoWRKY68启动子区域的CArG基序结合，促进PtoWRKY68的表达。因此，提出了调控杨树干旱响应的分子模块：PtoSVP.3-PtoWRKY68-PtoDTX49.1/PtoABF2.1/PtoRD26.1。为应对干旱胁迫，PtoSVP.3正向调控PtoWRKY68，PtoWRKY68等位基因通过诱导PtoRD26.1和PtoABF2.1的表达以及抑制PtoDTX49.1的表达，进而调控ABA信号传导和积累来增强杨树的耐旱性。

图5. PtoWRKY68调控杨树耐旱性的分子机制模型

小结：该研究提出了PtoWRKY68调控杨树耐旱性的分子机制模型。在干旱胁迫下，PtoWRKY68等位基因受PtoSVP.3的正调控，PtoWRKY68^hap1（上图）等位基因变异增强了其对PtoRD26.1和PtoABF2.1的结合和激活，并抑制了PtoDTX49.1，从而调节ABA外排和信号转导来获得耐旱性。PtoWRKY68^hap2（下图）比PtoWRKY68^hap1具有较低的结合亲和力和对下游靶点的激活能力。因此，杨树PtoWRKY68^hap1材料的抗旱性优于杨树PtoWRKY68^hap2材料。PtoWRKY68调控模块的鉴定为深入了解杨树耐旱性的遗传基础提供了新的见解，并为利用分子育种开发耐旱树木新品种提供了潜在的靶点。

参考文献：Fang Y, Wang D, Xiao L, Quan M, Qi W, Song F, Zhou J, Liu X, Qin S, Du Q, Liu Q, El-Kassaby YA, Zhang D. Allelic variation in transcription factor PtoWRKY68 contributes to drought tolerance in Populus. Plant Physiol. 2023 May 29:kiad315. doi: 10.1093/plphys/kiad315.