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DAP-seq在毛白杨PtoWRKY68等位基因调控干旱胁迫响应机制中的应用

更新时间:2023-07-06   点击次数:432次

干旱胁迫限制了树木的生长,并影响其地域性分布。为了应对干旱胁迫,植物进化出了一系列的生理生化反应机制,以保护植物细胞免受损害。因此,研究干旱胁迫下树木生理和光合作用变化的分子机制,将有助于培育耐旱性树木新品种,增强林木的生产力和经济价值。

2023年5月29日,北京林业大学生物学院林木分子育种团队的研究成果,发表在学术期刊Plant Physiology,文章题目为 “Allelic variation in transcription factor PtoWRKY68 contributes to drought tolerance in Populus"。该期刊的影响因子为8.005该研究使用DNA亲和纯化测序(DAP-seq) 技术鉴定了毛白杨转录因子PtoWRKY68的结合基序以及靶基因。揭示了PtoWRKY68基因等位变异通过调控ABA信号通路响应干旱胁迫的分子机制,为利用分子育种策略开发耐旱树木新品种奠定了遗传基础。

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该研究利用来自不同自然种群的300份中国白杨材料,对7个干旱相关性状进行全基因组关联分析(GWAS)。与充足水分条件下相比,在干旱条件下植物的水分利用效率(WUE)、ABA水平、脯'氨酸水平(PRO)均显著提高,气孔导度(Gs)、细胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)、叶绿素含量(Chl)则显著下降。在干旱条件下,中国西北(NW)和东北(NE)气候区域的干旱相关性状变化率明显高于南部(S)地区。在全基因组水平上,筛选到显著相关的一个SNP位点,位于Ptom.004G.01096起始密码子上游1.9Kb(与Gs显著相关),该基因编码WRKY家族转录因子PtoWRKY68。干旱胁迫下PtoWRKY68的表达水平显著增加,说明PtoWRKY68可能参与了毛白杨的干旱胁迫响应过程。过表达PtoWRKY68提高了转基因拟南芥(OE-1OE-3)的耐旱性,这表明PtoWRKY68是一个植物耐旱性的正调控因子。

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图1. 毛白杨干旱相关性状的全基因组关联分析

PtoWRKY68基因序列变异分析,发现WRKY结构域上游的一个12bp indel和WRKY结构域中的三个非同义变异与Gs显著相关。基于PtoWRKY68基因变异,将毛白杨分为两个单倍型类群:PtoWRKY68hap1(已在拟南芥中做了过表达)和PtoWRKY68hap2。等位基因频率调查显示PtoWRKY68hap1主要分布在NE和NW区域,PtoWRKY68hap2主要分布在S区域,这与当地降水的趋势相一致,符合杨树的地理适应特征。分析还发现PtoWRKY68hap1材料对干旱的响应明显高于PtoWRKY68hap2材料。然而,在干旱胁迫下PtoWRKY68hap1PtoWRKY68hap2的上调表达水平相当,所以两个单倍型群体对干旱胁迫响应的差异并不是由于PtoWRKY68等位基因表达水平的差异所致。在干旱胁迫下,PtoWRKY68hap1OE的耐旱性强于过表达PtoWRKY68hap2的转基因拟南芥植株(PtoWRKY68hap2OE),且二者都强于WT。此外,与WT和PtoWRKY68hap2OE相比,PtoWRKY68hap1OE中WUE、ABA、PRO的值更高,Gs和Tr的值更低。以上结果表明PtoWRKY68hap1对毛白杨耐旱性的进一步提高,可能与等位基因变异对干旱胁迫的不同响应有关,其中PtoWRKY68hap1PtoWRKY68hap2分别为耐旱等位基因和干旱敏感等位基因。

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图2. PtoWRKY68等位基因变异与毛白杨耐旱性显著相关

随后,对充足水分和干旱胁迫条件下的差异表达基因(DEGs)进行共表达网络分析。干旱胁迫下在PtoWRKY68hap1PtoWRKY68hap2两个单倍型群体之间有164个基因的表达存在显著差异,说明这些基因的表达受到PtoWRKY68等位基因变异的影响。采用DAP-seq技术分别鉴定了PtoWRKY68hap1和PtoWRKY68hap2的核心结合基序W1-box和W2-box及其靶点。KEGG分析发现靶基因主要富集于防御反应和植物激素信号通路中。基于DEGs、共表达网络分析和DAP-seq分析,筛选到3个与PtoWRKY68等位基因相关的靶基因:PtoABF2.1PtoRD26.1PtoDTX49.1。干旱胁迫下与在PtoWRKY68hap2材料中相比,在PtoWRKY68hap1材料中PtoABF2.1PtoRD26.1的表达量更高,而PtoDTX49.1的表达量更低。因此表明,PtoWRKY68介导了PtoDTX49.1PtoABF2.1PtoRD26.1在干旱胁迫下的转录调控。

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图3. DAP-seq鉴定PtoWRKY68等位基因潜在的靶基因

基于DAP-seq数据中的结合峰值、荧光素酶报告实验(DLRA)、凝胶阻滞实验(EMSA),说明了与PtoWRKY68hap2相比,PtoWRKY68hap1对靶基因的启动子具有更高的亲和力。干旱胁迫下与WT和PtoWRKY68hap2OE相比,在PtoWRKY68hap1OEAtABF2AtRD26的表达水平显著升高,AtDTX50的表达水平则明显降低。ABA敏感性实验说明PtoWRKY68等位基因在ABA依赖的气孔关闭中起重要作用。随后还发现与PtoWRKY68hap2材料相比,PtoWRKY68hap1材料的失水速度较慢、气孔关闭速度较快。因此,干旱胁迫下PtoWRKY68hap1通过增强干旱胁迫信号通路和ABA信号通路以及减少ABA外排,从而增加细胞中的ABA积累,最终增强植物的耐旱性。

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图4. PtoWRKY68等位基因直接结合靶基因的启动子并调控其转录活性

数量性状位点(eQTL)分析发现PtoSVP.3受干旱胁迫诱导表达,其表达水平与PtoWRKY68呈正相关。EMSA和DLRA实验验证了PtoSVP.3与PtoWRKY68启动子区域的CArG基序结合,促进PtoWRKY68的表达。因此,提出了调控杨树干旱响应的分子模块:PtoSVP.3-PtoWRKY68-PtoDTX49.1/PtoABF2.1/PtoRD26.1。为应对干旱胁迫,PtoSVP.3正向调控PtoWRKY68,PtoWRKY68等位基因通过诱导PtoRD26.1PtoABF2.1的表达以及抑制PtoDTX49.1的表达,进而调控ABA信号传导和积累来增强杨树的耐旱性。

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图5. PtoWRKY68调控杨树耐旱性的分子机制模型

小结:该研究提出了PtoWRKY68调控杨树耐旱性的分子机制模型。在干旱胁迫下,PtoWRKY68等位基因受PtoSVP.3的正调控,PtoWRKY68hap1(上图)等位基因变异增强了其对PtoRD26.1PtoABF2.1的结合和激活,并抑制了PtoDTX49.1,从而调节ABA外排和信号转导来获得耐旱性。PtoWRKY68hap2(下图)比PtoWRKY68hap1具有较低的结合亲和力和对下游靶点的激活能力。因此,杨树PtoWRKY68hap1材料的抗旱性优于杨树PtoWRKY68hap2材料。PtoWRKY68调控模块的鉴定为深入了解杨树耐旱性的遗传基础提供了新的见解,并为利用分子育种开发耐旱树木新品种提供了潜在的靶点。


参考文献:Fang Y, Wang D, Xiao L, Quan M, Qi W, Song F, Zhou J, Liu X, Qin S, Du Q, Liu Q, El-Kassaby YA, Zhang D. Allelic variation in transcription factor PtoWRKY68 contributes to drought tolerance in Populus. Plant Physiol. 2023 May 29:kiad315. doi: 10.1093/plphys/kiad315.