DNA pull down技术助力揭示AP2/ERF类转录因子提高芍药耐高温能力的分子机制

芍药是一种传统的中药材，并且具有欣赏价值，其生长发育经常受到高温胁迫的影响。褪黑素是一种内源性微分子吲哚胺化合物，在各种生物体中具有多种生理功能，大量研究表明调节与褪黑素生物合成相关的基因来提高植物对高温的耐受性。之前的研究中PlTDC被确定为P. lactiflora中褪黑素生物合成的关键基因。然而，关于内源性褪黑素与P. lactiflora耐高温之间的关系以及潜在的遗传机制的更深入的研究尚未报道。

2022年5月19日，扬州大学园艺与植物保护学院陶俊和赵大球教授团队共同在Plant, Cell & Environment（IF=7.79）杂志上发表了题为“Herbaceous peony AP2/ERF transcription factor binds the promoter of the tryptophan decarboxylase gene to enhance high-temperature stress tolerance"的研究性论文。

在本研究中提到，PlTDC在P. lactiflora耐高温胁迫中发挥了积极作用，并通过DNA pull-down技术鉴定了其表达受到AP2/ERF转录因子PlTOE3的激活，增强了褪黑激素的产生和高温耐受性。这些结果为研究植物高温胁迫的调控机制提供了新的思路。

图1.芍药中PlTDC和褪黑素含量的表达

1.PlTDC转录响应高温胁迫

为了分析PlTDC是否对高温胁迫有响应，首先通过qRT-PCR检测了高温胁迫下P. lactiflora叶片中PlTDC的转录水平。结果表明，高温胁迫诱导PlTDC转录。

图2.高温胁迫对过表达PlTDC的野生型和转基因烟草系的影响

2.烟草中PlTDC的异源过表达提高了烟草对高温胁迫的抗性

为了证实PlTDC在调节烟草耐高温性中的作用，在烟草中异种过表达PlTDC。将WT植株和转基因株系在42°C下胁迫72 h。WT植株全部枯萎，而转基因株系生长正常。此外，DAB染色显示转基因株系中H2O2含量明显低于WT植株。高温胁迫下转基因品系的REC和MDA含量显著低于WT植株，而Fv/Fm显著高于WT植株。同时检测相关保护酶基因的表达水平。Cu/ZnSOD、过氧化物酶基因(POD)和过氧化氢酶基因(CAT)，在高温胁迫下在转基因系中显著高表达。结果显示，过表达PlTDC可以通过增加褪黑素的产生来提高烟草对高温胁迫的抵抗力。

图3.高温胁迫对野生型和PlTDC沉默型植物的影响

3.沉默PlTDC可增加P. lactiflora对高温胁迫的敏感性

为了进一步研究PlTDC在P. lactiflora耐高温中的作用，利用VIGS技术抑制了P. lactiflora中PlTDC的转录。qRT - PCR结果显示，PlTDC沉默植物的转录物水平仅为WT植物的21.56%，褪黑素含量也相应降低。WT、pTRV2空载体转化和PlTDC沉默的植株高温胁迫，PlTDC沉默植株的生长与对照相比受到明显抑制。此外，与WT相比，PlTDC沉默植株的H2O2积累显著， REC和MDA含量增加，Fv/Fm和保护酶活性(SOD, POD和CAT)降低，在高温胁迫下，这些指标之间存在显著差异。这些结果证实了PlTDC通过调节褪黑激素的产生参与P. lactiflora高温应激反应的功能。

图4.PlTOE3序列分析

图5.PlTOE3激活了PlTDC的启动子活性

4.PlTOE3特异性激活PlTDC启动子

之后为确定上游调控区域对高温诱导PlTDC表达的重要性，克隆了其上游2402bp的启动子片段，随后，上游调控PlTDC的转录因子采用DNA pull down实验进行筛选。DNA Pull Down使用特殊标记的DNA探针作为诱饵，与提取的内源细胞核蛋白进行孵育，捕获与DNA探针特异性结合的蛋白，最终使用蛋白质谱的方法，鉴定出特异性结合的蛋白。结果显示，仅获得1个乙烯响应元件结合因子(AP2/ERF)转录因子。该转录因子接近拟南芥TOE3蛋白，聚集在AP2亚家族中，之后将这个序列命名为PlTOE3。

为确定PlTOE3是否与PlTDC启动子特异性结合，进行了酵母单杂交Y1H和荧光素酶互补实验LRA进行验证。Y1H实验表明，PlTOE3可以与PlTDC启动子相互作用。LAR证实，PlTOE3激活了烟叶中的PlTDC启动子。

图6.PlTOE3的表达和亚细胞定位

5.PlTOE3转录对高温胁迫的响应

为了分析PlTOE3是否也对高温胁迫有响应，检测了高温胁迫下叶片中PlTOE3的转录水平。PlTOE3的转录水平在P. lactiflora发育过程中随着温度的逐渐升高而升高，并随着高温胁迫时间的延长呈现先升高后降低的趋势。这表明，PlTOE3与PlTDC具有相同的表达模式，意味着PlTOE3可能积极参与调控高温抗性。此外，表达PlTOE3‐GFP融合蛋白的烟叶在细胞核中显示出强烈的信号，表明PlTOE3是一个核定位蛋白，这与上述NLS序列的结果一致。

图7.高温胁迫对过表达PlTOE3的野生型和转基因烟草系的影响。

图8.高温胁迫对野生型和PlTOE3沉默型植物的影响

6.PlTOE3正调控对高温胁迫的抗性

将PlTOE3在烟草中过表达，转基因株系中烟叶NtTDC1的转录本水平比WT植株高17倍以上。在42°C高温胁迫72 h后，转基因植株生长正常，与WT植株相比，ROS积累、REC和MDA含量显著降低;相比之下，Fv/Fm和保护酶基因(Cu/ZnSOD、POD和CAT)表达水平显著升高。利用VIGS技术在P. lactiflora中沉默PlTOE3， PlTOE3和PlTDC的转录水平分别被抑制后，褪黑素含量、ROS、REC和MDA含量增加，Fv/Fm和保护酶活性(SOD, POD和CAT)降低。上述结果与PlTDC转基因结果一致，表明PlTOE3正调控了高温胁迫抗性。

图9.PlTOE3调控芍药耐高温胁迫的模型

小结

高温诱导了PlTOE3的表达，这是一种核定位蛋白。这些结果与先前的研究一致。然而，很少有研究关注TOE3在高温胁迫耐受中的作用;在本研究中证明了P. lactiflora中AP2/ ERF转录因子PlTOE3靶向PlTDC启动子，这是增加褪黑素产生的关键因素。褪黑素不仅作为一种抗氧化剂直接消除活性氧还作为一个信号来激活SOD-CAT途径消除ROS，最终增强P. lactiflora的高温胁迫耐受性。

DNA Pull Down技术简介

DNA Pull Down是一种新颖的DNA-蛋白互作技术，能够鉴定与特定DNA序列结合的蛋白（转录因子或者DNA结合蛋白）。DNA Pull Down使用特殊标记的DNA探针作为诱饵，与提取的内源细胞核蛋白进行孵育，捕获与DNA探针特异性结合的蛋白（比如转录因子），最终使用蛋白质谱的方法，鉴定出特异性结合的蛋白。DNA Pull Down的优势在于，探针的设计长度范围广，蛋白保持天然结构，实验周期短，通量高，特异性强，假阳性率低，应用范围广（适用于原核生物与真核生物）。将DNA Pull Down与蛋白质谱结合，又具备高灵敏度的特点。

技术优势

探针长度设计范围广

蛋白提取自新鲜组织和细胞，保持天然构象

特异性强，假阳性率低

适用于真核生物和原核生物

实验周期短，高通量，高灵敏度