DAP-seq鉴定BcERF070下游靶基因，揭示乙烯调控小白菜开花机制

不结球白菜（Pak-choi），俗称小白菜，是一种原产于中国的多叶状蔬菜，已逐渐在世界范围内种植。小白菜易于早熟的特性，限制了生长发育和产量积累。因此，了解小白菜的开花调控机制对育种和产业具有重要意义。

2024年1月25日，南京农业大学白菜系统生物学实验室的研究成果发表在Plant Physiology期刊上（影响因子7.4），题目为“ETHYLENE RESPONSE FACTOR 070 inhibits flowering in Pak-choi by indirectly impairing BcLEAFY expression"。该研究使用DNA亲和纯化测序（DAP-seq）技术鉴定了小白菜中BcERF070的下游靶基因，揭示了BcERF070响应乙烯抑制小白菜开花的潜在分子机制。

1.BcERF070响应乙烯，延缓小白菜开花

在外源乙烯处理条件下，小白菜开花延迟，莲座叶数量增加，BcERF070的表达增加，并在处理2 h时达到峰值。此外，BcERF070的转录水平在整个营养生长期逐渐下降，并在生殖期达到谷值。因此BcERF070参与了乙烯介导的开花调控。BcERF070基因沉默后，促进小白菜提早开花，莲座叶数量降低，BcFT诱导表达。因此，BcERF070在小白菜开花过程中起到负向调节作用。乙烯处理的沉默植株开花时间明显提前，但晚于未处理组。由此表明BcERF070参与小白菜开花调控的途径有很多。

图1. BcERF070基因沉默后促进小白菜开花，并响应乙烯。

2.BcERF070与BcMLP328相互作用

采用Y2H实验筛选到了BcERF070的互作蛋白BcMLP328，随后使用BiFC、LCI、GST pull down、Co-IP实验验证了这一结果。然而，BcERF070和BcMLP328相互作用调控开花的机制尚不清楚

图2. BcERF070与BcMLP328相互作用。

3.BcMLP328促进小白菜开花

乙烯处理小白菜促使BcMLP328的表达量降低。此外，BcMLP328仅在花器官中高表达。这表明BcMLP328可能与开花过程有关。随后在小白菜中构建了BcMLP328的过表达株系和沉默株系，通过表型观察分析和开花相关基因（BcSOC1、BcSPL15、BcFT、BcAP3、BcTEM）表达量检测，实验结果表明BcMLP328促进小白菜开花。然而，BcMLP328促进开花的机制尚不清楚。

图3. BcMLP328响应乙烯，并促进小白菜开花。

4.BcMLP328增强了BcbHLH30对BcLFY的转录活性

采用Y2H实验筛选到了BcMLP328的互作蛋白BcbHLH30，随后使用LCI、BiFC、Co-IP实验验证了BcMLP328和BcbHLH30在体内和体外的互作。随后在小白菜中构建BcbHLH30沉默株系，发现在沉默株系中开花延迟、莲座叶增多、开花调控基因（BcFT和BcLFY）表达量降低。这些结果表明，BcbHLH30正调控小白菜开花过程。

图4. BcbHLH30与BcMLP328相互作用，促进小白菜开花。

采用Y1H实验筛选BcbHLH30下游靶基因，发现BcbHLH30直接结合花相关基因BcLFY的启动子，激活其表达。LUC实验验证了这一结论。随后，ChIP-qPCR实验检测到在过表达BcbHLH30的小白菜株系中含有CATTTG-box的P2片段被显著富集，EMSA实验证明了BcbHLH30与BcLFY启动子区的CATTTG-box结合。共转化烟草叶片实验表明BcMLP328增强了BcbHLH30对BcLFY的激活能力。

图5. BcbHLH30与BcLFY启动子结合并增强其表达。

5.BcERF070削弱了BcMLP328-BcbHLH30复合物对BcLFY的激活

为了验证BcERF070对于BcMLP328与BcbHLH30互作的影响，使用LCI实验证明，BcMLP328和BcbHLH30共转染组中荧光明显增强，然而在加入BcERF070之后，荧光强度显著降低。EMSA实验也验证了这一结论。因此，BcERF070对BcMLP328与BcbHLH30的相互作用产生负向影响，这可能会降低BcMLP328-BcbHLH30复合物对BcLFY的转录激活。

推测BcERF070是通过破坏BcMLP328-BcbHLH30复合物进而延迟开花，那么BcMLP328沉默株系、BcERF070和BcMLP328双沉默株系的开花时间理应相似。但出乎意料的是，BcERF070和BcMLP328双沉默株系的开花时间早于BcMLP328沉默株系，莲座叶也较少。由此推测BcERF070也可能通过破坏BcMLP328-BcbHLH30复合物以外的途径来影响开花。

图6. BcERF070削弱了BcMLP328-BcbHLH30复合物的激活活性。

6.BcERF070通过直接与BcBBX29启动子结合增强其表达

采用DAP-seq分析可视化观察到在Bcc29的启动子区域存在较强的BcERF070结合峰，以及在BcBBX29的启动子上可能存在结合区域。Y1H、Dual-LUC报告实验、EMSA实验进一步验证了BcERF070与BcBBX29启动子结合并激活其表达。与对照株系相比，BcBBX29沉默株系的开花时间更早、莲座叶更少、BcFT表达更强。在过表达BcBBX29的拟南芥中观察到开花时间更晚、莲座叶更多。以上实验结果表明，BcERF070通过直接激活BcBBX29的转录来延缓开花。

图7. BcERF070直接与BcBBX29启动子结合，激活其表达。

图8. 小白菜中BcERF070调控晚开花的分子机制模型。

在没有乙烯的情况下，BcERF070的表达量较低，导致开花提前。然而，在乙烯存在的情况下，BcERF070的表达被诱导，增加的BcERF070通过直接互作破坏BcMLP328-BcbHLH30复合物对BcLFY的激活，导致开花延迟；另外BcERF070还通过直接促进开花抑制子BcBBX29的表达来抑制BcFT的表达，进而诱导晚开花。

小结：该研究提出了BcERF070响应乙烯调控小白菜开花的分子机制。外源乙烯处理增加了BcERF070的表达，延缓了开花。BcERF070通过削弱小白菜中BcMLP328-BcbHLH30复合物对BcLFY的激活来延迟开花，此外BcERF070还直接促进开花抑制子BcBBX29的表达，从而降低BcFT的表达，进而延缓开花。本研究为乙烯介导的小白菜晚开花提供了见解，并为应用乙烯调控作物生产奠定了基础。

文献来源：Zhanghong Yu, Xiaoshan Chen, Yan Li, Sayyed Hamad Ahmad Shah, Dong Xiao, Jianjun Wang, Xilin Hou, Tongkun Liu, Ying Li. ETHYLENE RESPONSE FACTOR 070 inhibits flowering in Pak-choi by indirectly impairing BcLEAFY expression, Plant Physiology, 2024, kiae021,