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文章分享 | Ribo-seq与RNA-seq联合分析揭示uAUG-ds翻译调控机制

更新时间:2024-06-14   点击次数:147次

技术简介

RNA-seq主要从转录组水平分析基因的表达调控机制,检测用于核糖体翻译的RNA序列及二级结构。Ribo-seq主要用于检测核糖体翻译的起始位置、翻译富集区和翻译终止位置。RNA-seqRibo-seq联合分析可以准确检测mRNA上游5’UTR区的uORFs翻译调控结构,揭示生物模式触发免疫下的翻译调控机制。

 

文献速递

2023年发表在Nature上的“Pervasive downstream RNA hairpins dynamically dictate start-codon selection"文章,发现在uORFs区的uAUGs下游存在双链结构,可动态调节mORFs区蛋白的表达。文章主要提出了对防御性蛋白表达基因(顺势作用)的两种调节状态:

l  正常情况下,uAUG-ds结构诱导核糖体选择性翻译uORF,抑制下游mORFs翻译,抑制防御性蛋白的表达。

l  在受到免疫攻击后,诱导RNA解旋酶将uAUG-ds结构打开,使核糖体可以绕过uAUGs,翻译下游防御蛋白。

 

研究首先对正常处理和elf18诱导免疫处理的拟南芥样本进行RNA-seqRibo-seq测序。综合RNA-seq数据和Ribo-seq数据,对检测到的25,554个可表达的转录物进行分析,筛选得到13,051mAUGs上游5’UTR含有uAUGs的可表达转录物(含有uAUGs)。对比正常处理和elf18处理样本的翻译效率(TE),将这13,051个转录物分为TE-upTE-ncTE-down三组,通过GO分析发现了TE-up组基因与相应环境胁迫等生物过程有关,而TE-down组基因主要是与生长相关代谢过程有关(Extended Data Fig.2)。

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Extended Data Fig. 2 Global analysis of translational dynamics and dual-luciferase reporter study of uAUG-containing transcripts.

 

为了鉴定uAUGs在翻译调控中的作用,研究又从这13,051个转录物中筛选出翻译型uAUGs,发现翻译型uAUGsTE-up组中显著富集,表明了uAUGs在调节免疫相关翻译中具有普遍作用(Fig. 1b)。研究还对比了正常处理和elf18诱导免疫处理下,TE-up组转录物中的翻译型uAUGs特征,发现在正常处理下翻译型uAUGs的翻译起始率较高(核糖体占有率),而elf18处理后这种类型的uAUGs翻译起始率显著降低(Fig. 1e)。由于uAUGs起始的翻译通常会抑制下游mORFs翻译,所以在elf18处理下uAUGs起始的翻译的减少也解除了对下游mORFs翻译的抑制作用。

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Fig. 1 Translational dynamics of uORF-containing transcripts.

 

为了确定uAUGs影响翻译起始的机制,研究首先评估了所有表达转录本中的Kozak序列(一级结构),发现mAUGsuAUGs仍具有更好的Kozak序列,而且TE-upTE-ncTE-down转录物中翻译型uAUGsKozak序列也是相似的(Fig. 2a),表明了在TE-up转录物中elf18介导的从uAUGsmAUG的翻译起始的转换还与其他序列结构有关。研究下一步使用SHAPE-MaP法来探究RNA二级结构对翻译起始识别的影响。研究定量检测了细胞内的RNA结构,发现具有较高SHAPE反应的区域更可能是单链结构。研究进一步使用正常处理和elf18处理样本中mRNAs的数据进行结构建模,发现尽管5’UTR取和CDSs区在SHAPE反应上是相似的,但在所有表达转录物中mAUGs下游双链结构或蛋白质结合水平较高(低SHAPE反应)(Fig. 2b)。研究同时对上下游核苷酸SHAPE反应分析发现,mAUGs和翻译型uAUGs下游比上游表现出明显的低SHAPE反应,而非翻译型uAUGs没有这种现象(Fig. 2c)。研究又对比了正常处理下和elf18处理下的不同转录效率(TE-upTE-ncTE-down)转录物种的uAUGsSHAPE反应情况,发现正常处理下TE-up转录物中的翻译型uAUGs下游具有较低的SHAPE反应,表明了uAUGs下游存在二级结构。研究通过缺乏蛋白质实验,排除蛋白质结合导致低SHAPE反应,进一步确认了双链RNA二级结构(mAUG-dsuAUG-ds)影响翻译起始调控的可能性。

为了直接观察结构模式与AUGs的翻译起始的关系,研究开发了基于一级序列和结构数据的TISnet模型,来预测翻译的起始位点。经过mAUGsinternal AUGs数据训练的模型,可以预测到翻译型uAUGs和非翻译型uAUGs之间存在显著差异(Extended Data Fig. 5d)。模型预测出的起始型uAUGs下游序列比非起始型具有更高的负折叠自由能(易形成二级结构)(Fig. 2e)和更高的核糖体占有率(Fig. 2i),表明TISnet模型也可以准确预测翻译型uAUGs。以上研究表明了在正常情况下,AUGs下游RNA二级结构可以促进该位置的翻译起始,与上游RNA二级结构抑制翻译起始相反。

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Fig. 2 Global SHAPE-MaP and deep learning analyses reveal hairpin structures downstream of mAUGs and uAUGs that have a role in dictating translation initiation.

 

通过分析Ribo-seq数据,研究发现了TE-up转录物中elf18处理可以启动uORFs翻译起始到mORFs翻译起始的转变。首先是观察到在elf18处理下uAUGs下游SHAPE反应增加(二级结构解链),并且TE-up转录物uAUG-ds结构变化受免疫诱导影响程度更大(Fig. 3a)。研究提出了假设,免疫诱导降低了uAUG-ds结构复杂性,启动下游mAUGs的翻译。研究进一步通过构建uAUG2-ds突变表达系统,验证了uAUGs下游双链结构有助于通过促进uAUGs的翻译起始来抑制uORF介导的下游mORF翻译。研究者还在植物和人细胞系中证实了这些结果,并通过对肿瘤抑制基因的突变体分析,发现了抑制BRCA1mRNA翻译的uAUGs-ds结构(Fig.3g right)。

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Fig. 3 RNA secondary structures downstream of uAUGs dynamically regulate translation.

 

接下来研究者试图去了解elf18诱导是如何促进uAUGs-ds解旋的。研究者主要选择了DEAD-box RNA解旋酶进行研究,发现免疫诱导的解旋酶表达水平增加可能促进uAUGs-ds的解旋,从而降低uAUG介导的mORF翻译的抑制。研究通过构建解旋酶表达系统证实了elf18诱导的RNA解旋酶参与了TE-up转录物中uAUG-ds的解旋,并促进了下游防御蛋白的表达。

 

小结

研究使用RNA-seqRibo-seq和深度学习算法联合分析了转录组范围的翻译和结构特征,并且将结果扩展到其他生物体中,揭示了uAUG-ds作为调节基因表达的分子开关,动态调节防御性蛋白基因及肿瘤抑制基因的表达。