N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中RNA最常见的内部修饰，在多种生物过程，如RNA稳定性、剪接、转运和翻译中发挥关键调控作用。但检测所需大量的RNA阻碍了哺乳动物早期胚胎中的m6A分析。本研究通过应用低起始量的甲基RNA免疫沉淀和测序技术（picoMeRIP-seq），成功绘制了小鼠卵母细胞和着床前胚胎中N6-甲基腺苷（m6A）修饰的动态图谱，揭示了m6A修饰在调控早期胚胎发育、基因表达、母体到合子转换过程中的关键作用，以及m6A通过在逆转录转座子衍生的RNA上的富集来维持基因组稳定性和细胞特性。为深入理解m6A修饰在哺乳动物早期发育中的调控机制提供了宝贵的数据资源和科学见解。
1.小鼠卵母细胞和早期胚胎中m6A的全局视图
为了评估m6A修饰的全局水平，作者对处于卵母细胞期（GV）和中期II（MII）阶段的卵母细胞，以及处于合子、两细胞、四细胞、桑椹胚和囊胚阶段的早期胚胎进行了m6A的免疫荧光染色，在所有阶段都检测到了m6A的存在。同时利用picoMeRIP-seq技术，在GV、MII、合子、两细胞、八细胞和囊胚六个阶段（每个阶段2个生物学重复）生成了全转录组范围的m6A图谱。平均每个阶段识别出11965个m6A峰值，每个阶段携带m6A修饰的基因数量分别为5,776（GV）、5,076（MII）、4,579（合子）、4,851（两细胞）、5,905（八细胞）和6,234（囊胚）。这些m6A峰值在终止密码子附近显著富集，并且在所有阶段显示出清晰的RRACH（R=G/A，H=A/C/U）共识基序。进一步通过全转录组相关性分析和主成分分析（PCA），结果显示六个阶段一致性均非常高，同时呈现明显的聚类。这些结果为理解m6A在早期胚胎发育中的调控作用提供了重要的数据基础。
图1.小鼠卵母细胞和胚胎的RNA m6A图谱
2.母体到合子转换期间的m6A动态变化
母体到合子转换期间是哺乳动物胚胎发育早期的一个关键阶段，此时胚胎从依赖母体提供的基因产物转变为依赖自身基因表达，在小鼠中该过程发生在受精后的两细胞阶段。为评估该转换期间的m6A动态变化，作者首先定义2个概念，分别是m6A+和m6A-（一个基因如果其任何转录本在给定阶段的≥1个生物学重复中与m6A峰值重叠，则为m6A+，否则为m6A-），在6个阶段中共有1,579个基因被鉴定为m6A+，同时GO分析表明m6A+和m6A-在功能上有明显区别。进一步对6个阶段的m6A状态进行分析，发现在合子和两细胞阶段之间观察到m6A状态的显著变化，与合子相比两细胞阶段有2,356个基因获得了m6A，2,084个基因失去了m6A。其中，66%的m6A获得和62%的m6A丢失基因可以通过基因表达重编程来解释，同时母体RNA降解和合子基因组激活（ZGA）在这一时期同步发生。
接下来，作者通过香农熵的方法评估了特定阶段表达基因的m6A图谱。共识别了5,996个特定阶段表达的基因（分为8组），m6A+的分布范围在40%~70%不等。整体来看转录因子与其它表达基因相比显示出显著的m6A富集，并主要集中在与早期胚胎多能性维持和与功能分化有关的主要转录调控因子上。其中85%特定阶段表达的转录因子的mRNA被m6A标记，89%的转录因子在至少一个发育阶段存在m6A修饰。表明m6A+基因与转录调节强烈相关，以上分析结果为未来研究探索m6A在早期胚胎发育中的潜在作用提供了基础。
图2.在发育过程中m6A甲基化动态的特征分析
3.衰变基因和 ZGA 基因的 m6A 标记和 miRNA 靶向
为了评估m6A修饰在母源性RNA降解及合子基因激活过程中的作用。作者首先识别到2293个母源性降解基因（Decay）与726个合子基因（ZGA）。并根据受精前后不同的降解模式将Decay分为3个亚群，分别是M-Decay、Z-Decay、C-Decay。其中M-decay基因中m6A+基因的比例小于30%，Z-decay和C-decay基因在卵母细胞中的m6A+基因比例均超过了50%，而在两细胞阶段的ZGA基因m6A+基因比例为46%。进一步通过GO分析，证明m6A+降解基因主要与凋亡、细胞形态调节、生殖细胞发育相关，而m6A+ ZGA基因在胚胎发生的一系列过程中均显著富集，包括转录调控、细胞增殖和胚胎着床。
之前研究结果已证实mESCs中的miRNA倾向于靶向m6A修饰的区域。作者想进一步探究miRNA是否靶向m6A+降解基因和ZGA基因，通过与miRNA表达数据比较得出，降解基因和ZGA基因中miRNA更倾向于靶向m6A+基因，且降解组中miRNA靶向的m6A+基因比例显著高于ZGA组。同时发现miRNA靶向的m6A+基因在降解组和ZGA组中似乎介导相反的功能。以上结果揭示了m6A修饰在小鼠发育中的重要作用，特别是母体RNA降解、合子基因激活以及与miRNAs相互作用方面。
图3.在发育过程中m6A标记和miRNA靶向谱在Decay和ZGA基因上的特征分析
4.m6A沉积于逆转录转座子衍生的RNA上
逆转录转座子是指一类可以通过逆转录过程在基因组中移动的DNA片段，主要分为LTR、LINE、SINE三种。先前已有研究表明m6A通过调节逆转录转座子衍生的RNA分子的稳定性和表达，从而影响干细胞的功能和状态。本研究发现超过50%的m6A峰值与逆转录转座子位点重合，且逆转录转座子位点主要来自ERVL-MaLR、ERVL和L1/LINE-1家族的五个亚家族，包括MTA、ORR1A0、ORR1A1、MERVL和L1Md_T。5个位点在富集时期与程度、分布模式以及富集区域基序上均存在差异。从富集时期与程度程度来看，MTA在卵母细胞和合子中m6A富集较强，MERVL在两细胞胚胎中m6A富集较丰富；从分布模式来看MTA序列上的m6A分布相对均匀，而MERVL、L1Md_T、ORR1A0和ORR1A1上的m6A占据位置有明显偏好；从富集区域基序来看GGACU基序在MTA、MERVL、ORR1A0和ORR1A1的m6A富集区域中频繁出现，而RRACU基序在所有五个逆转录转座子亚家族的整个序列中都很丰富。以上研究结果证实了m6A修饰在调控逆转录转座子活性在维持基因组稳定性和细胞特性发挥重要作用。
图4.m6A在逆转录病毒衍生的RNA上的沉积
结论
该研究通过使用低输入甲基RNA免疫沉淀和测序技术，克服了在哺乳动物早期胚胎中进行m6A分析的难题。研究发现，在从母体到合子转变的过程中，m6A广泛存在于母体遗传的转录本和合子激活的基因中，并且这些m6A标记的母体遗传转录本更可能被miRNAs靶向，而特定的逆转录转座子RNA，如MTA和MERVL，也被发现富含m6A修饰。这些发现不仅补充哺乳动物卵母细胞和早期胚胎的转录组范围内的m6A图谱的空白，同时为未来研究m6A在哺乳动物早期胚胎发育中的调控作用奠定了基础。
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