文章标题：Identification of plasma miR-4505, miR-4743-5p and miR-4750-3p as novel diagnostic biomarkers for coronary artery disease in patients with type 2 diabetes mellitus: a case-control study
发表年限：2024年
期刊：Cardiovascular Diabetology
影响因子：8.5
研究背景
2 型糖尿病（T2DM）和冠状动脉疾病（CAD）是常见的共存临床疾病，在全球范围内的发病率仍在增长。最近，循环RNA（miRNA）已成为心脏代谢疾病中的新型分子参与者。本研究旨在确定特异性 miRNA 特征作为 T2DM 中 CAD 的候选生物标志物，并描绘导致糖尿病动脉粥样硬化的潜在 miRNA 依赖性机制。
研究方法
共收集来自患有和不患有 CAD 的 T2DM 患者、CAD 患者和健康对照的 38 份血浆样品，使用微阵列对 2,578 个 miRNAs 进行表达谱分析。为了研究差异表达 （DE）-miRNA 靶基因的调控作用，利用多种生物信息学工具进行了功能注释和通路富集分析。然后，利用 Cytoscape 软件中的 STRING 数据库建立蛋白质-蛋白质相互作用网络，进行聚类分析和枢纽基因鉴定。在 94 名参与者的较大复制队列中进行逆转录定量实时聚合酶链反应 （RT-qPCR） 以验证微阵列数据。采用受试者工作特征分析评价 miRNAs 的诊断价值。采用多因素 logistic 回归分析开发基于 miRNA 的诊断模型。
本文中通过Cytoscape v3.10.0 软件中的STRING数据库插件（stringApp v2.0.1）进行蛋白质互作网络构建，来确定已验证的差异miRNA在T2DM-CAD中的调控作用，综合置信度得分大于0.4的相互作用被保留。然后使用Cytoscape v3.10.0软件中的分子复合物检测（MCODE v2.0.3）插件来于深入了解PPI网络中可能紧密连接的基因模块（簇、子网络），并进行富集分析（Figure 1）。通过Cytoscape v3.10.0 软件中的 CytoHubba 插件过滤PPI网络，找到关键中心基因（Figure 2）。
Figure 1：
Figure 2：
Cytoscape是一个开源的软件平台，用于可视化分子相互作用网络和生物途径，适用于复杂网络分析，同时也具有很多实用性的插件。今天我们来一起用软件和插件，按文章中的逻辑和操作步骤，来画一个蛋白质互作网络图。
Cytoscape在windows平台只有64位版本在Cytoscape获取最新下载地址，请注意，Cytoscape安装需要配套的Java运行环境，所以需要先安装Java，安装好后再进行Cytoscape的安装，根据安装提示进行下一步即可。
安装Java后，需要配置环境变量，在电脑开始菜单搜索“编辑系统环境变量"（win 11），点击环境变量：
新建系统变量，变量名输入JAVA_HOME，变量值输入Java安装路径，点击确定保存：
编辑Path环境变量，新建一行输入Java路径，点击确定保存即可完成环境变量配置。
开始菜单输入cmd，继续输入java -version查看是否安装成功，Java版本：
这里我们安装的Cytoscape版本是3.10.3，Java版本为17.0.13，安装好后我们来了解一些基础功能。
打开Cytoscape后，启动面板可以大致分为以下几部分内容：
1.菜单
●File：文件菜单。可以进行文件的导入和输出，常用选项有：
Ø Import：导入网络或表格。
Ø Export：导出网络图片或表格，也可导出为网页。
Ø Open Session / Open Recent Session：可以打开 Cytoscape 文件或列出最近打开的会话文件，以便快速访问。
Ø New Network：创建新网络，可以编辑空白网络，也可以从一个现有网络创建。
Ø Save Session：保存会话文件。
●Edit：编辑菜单。可以进行撤销重做等。撤消和重做功能适用于最近执行的 10 个任务。可以将注释向前、向后以及将其推或拉到前景层和背景层，常用选项有：
Ø Undo/Redo：将所有已删除的节点和边进行恢复或重做。
Ø Destroy Networks/Views：删除网络或删除现有的视图，再次create view后回到初始风格状态。
Ø Remove Duplicated Edges：用于删除重复的边（具有相同的源节点和目标节点），只保留一条边。
Ø Remove Self-Loops ：用于删除具有相同的源和目标节点的边。
Ø Remove Selected Nodes and Edges：用于删除选定的节点和边。
●View：视图菜单。可以显示或隐藏各个窗口，也可以进行放大缩小或适配网络视图。
●Select：选择菜单。可以选择点或边进行展示和隐藏。
●Layout：布局菜单。可以手动调整节点位置，也可以通过布局菜单中的预设布局算法进行网络图布局的调整，这些布局算法也可以将节点和边的数据列考虑进去。常规布局有：
Ø Layout Tools：节点布局工具，可以帮助自动化或微调布局。选择个别节点或全部节点，可以对边的长度、方向进行调整，也可以设置节点相对位置。
Ø Grid Layout：网格布局，所有节点排列成方形网格。
Ø Hierarchical Layout：分层布局，展示网络中的主要方向，节点被放置在按层次排列的层级中，通过最小化边的交叉数量对每个层内的节点进行排序。
Ø Circular Layout：环形布局，强调网络中的分组和树状结构，通过分析结构的连通性对网络进行分组，并将分组结果布局成单独的圆，圆本身以放射状树形布局的方式进行排列。
Ø Stacked Node Layout：堆叠节点布局，将节点纵向堆叠排列进行布局。
Ø 还有一些通过安装插件实现的布局选项，根据实际效果选择合适美观的布局操作。
●Apps：应用菜单。可以进行插件管理，为已安装的插件提供菜单选项。常用的插件有：
Ø stringApp：从Cytoscape内导入string-db的蛋白质互作网络。
Ø MCODE：对网路中节点和边进行聚类分析。
Ø CytoHubba：过滤互作网络，筛选核心基因。
Ø yFiles Layout Algorithms：更多网络图布局。
●Tools：工具菜单。包含多种高级功能，如下所示：
Ø Analyze Network：网络分析，查看节点、边、连接的数量，网络直径、半径、聚类系数等。
Ø Enrichment Table：富集分析，需要有与查询基因相关的物种及gene symbols。
Ø Open Web Page：可以打开浏览器窗口，快速查看Cytoscape特定网页。在作图时参考Cytoscape使用手册的内容。
●Help：帮助菜单。可以查看用户使用手册。
Ø Citations：可以查看Cytoscape的主要参考文献和已安装插件的参考文献。
2. 常用功能图标
这些功能也可以通过菜单使用。将鼠标指针悬停在图标上，短暂停留将会显示该工具的提示信息，右击工具栏可以自定义内容。
a.从Network Data Exchange (NDEx)中导入或导出网络。
b.打开或保存网络文件（.cys）。
c.从文件中导入网络或导入表格，添加到目前的网络中。
d.针对网路主视图窗口的可视化操作，放大、缩小、适配屏幕、选择部分节点适配屏幕。
e.恢复网络的初始状态。
f.找到选中节点的邻近节点，可以多次点击；隐藏选中节点和边；显示被隐藏的节点和边。
g.使用选择的节点和边形成自网络。
h.富集分析。
3. 网络面板
修改节点、边、网络的样式，包括颜色、节点大小、字体、形状等，也可以修改网络图整体背景颜色。
4.显示网络的主网络视图窗口
显示网络图，可以同时显示多个网络图窗口，网络视图底部是一系列视图工具。将鼠标指针悬停在图标上，短暂停留将会显示该工具的提示信息。
a.将所有已经加载的网络以网格样式排列各个窗口视图；显示当前选择的网络。
b.独立网络视图窗口，将网络图窗口与软件主窗口分开。
c.导出网络或网络图。
d.强制渲染图形细节（默认关闭）；关闭或打开节点选择；关闭或打开边选择；关闭或打开注释选择；关闭或打开节点或边的标签选择。后四个选项影响你在视图窗口中是否能选择拖动节点、选择边，移动节点标签等。
e.隐藏鸟瞰视图。在大型网络图中方便查看每个位置的节点。
5.表格面板
显示节点和边的数据，可以修改相应数据。导入或导出表格，添加或删除表，还可以筛选想要显示的列。
6.命令面板
可以读取和执行脚本文件，文件中每行为发送到应用的命令。
插件可以直接在Cytoscape App Store进行搜索下载。
也可以在Cytoscape中的App Store →Show App Store中进行查找，跳转对应插件网页，相比直接的网页搜索效果更精确，网页搜索会将包含相应单词的插件都显示出来。
进入网页后下载插件文件，下载好后回到Cytoscape，选择Install Apps From File 进行安装。这里我们安装了stringApp、MCODE和CytoHubba，尝试复原文献中的蛋白互作网络图的样式。
首先我们可以下载得到开头文章中所用的互作网络数据，如图，Table 5中是作者构建的12个差异miRNA验证靶基因的PPI网络。其中，3个（hsa-miR-4505, hsa-miR-4743-5p, hsa-miR-6846-5p）上调，共341个靶基因，9 个（hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-4668-5p, hsa-miR-4706, hsa-miR-6511b-5p, hsa-miR-6750-5p, hsa-miR-4750-3p, hsa-miR-320e, hsa-miR-4717-3p, hsa-miR-7850-5p）下调，共1991个靶基因。这里我们用上调的miRNAs涉及到的靶基因进行作图，共341个。
第一步：使用Cytoscape中的STRING数据库，鉴定网络图存在的节点和边。
1. 通过File→Import→Network from Public Databases，导入互作网络数据库。
2.切换至STRING：protein query，选择对应物种，输入靶基因列表，其余参数可以保持默认状态，也可以根据需要自行选则。
其中Network type是指网络类型，默认选择full STRING network，指保留全部来源的互作网络，既有实际证据证明的，也包含基于临近基因、文本检索、共表达、共定位等预测的可能存在的蛋白相互作用。 physical subnetwork则仅保留存在实质结合或形成蛋白复合体的相互作用。Confidence (score) cutoff指互作置信度筛选值，在STRING中，0.4为中等可信度，0.7为高可信度，0.9为最高可信度，0.15为较低可信度。Maximum additional interactors 指附加的互作蛋白数量最大值，最多可添加的互作数量，可以将原始查询中未包含但预测到会发生相互作用的蛋白质添加到网络中。Use Smart Delimiters可以使用只能分隔符正确分隔输入的蛋白质名称和标识符。Load Enrichment Data指加载富集数据对蛋白进行富集分析。
3.导入后即可获得相应的蛋白质互作网络图，可以通过右侧选项更改图片呈现样式，修改标识符位置，隐藏或显示单独节点，点击任意节点可以查看对应蛋白的描述和结构。
还可以通过Tools→Analyze Network分析网络，查看点和边的数量等信息。
第二步：使用Cytoscape中的MCODE 插件，对所有节点和边进行聚类分析。
1. 首先打开Apps→MCODE，参数一般维持默认即可。其中，Find Clusters，可以从全部网络图中寻找，也可以从选定的节点和边中寻找。Include Loops，选择后MCODE会包含循环的边(self-edges)。Degree Cutoff指对节点评分的最小连接数，如仅与另一个节点共享一个节点的Degree值为1，有效最小数值为2，防止单连接节点人为的获得高节点数。Haircut，指一些满足Degree Cutoff的节点可能仅通过一条边连接到集群，Haircut会删除这类单连接节点。K-Core：过滤掉不包含最少K 值的最大互连子集群的集群，子集群中的节点degree都要大于K。 Max.Depth：子节点到集群中其他节点的距离，MCODE可以在该距离内搜索集群的子节点。
分析完成后，可以把每个自网络单独输出，进行调整。
可以通过Layout，选择合适的布局输出保存成图片或文件。
第三步：使用Cytoscape中的cytoHubba 插件，过滤 PPI 网络，筛选核心基因。
1.点击左侧的cytoHubba工作区，选择目标分析网络，点击calculate，选择关键基因数量排名靠前的十个，使用BottleNeck算法进行分析，或者选择感兴趣的基因。
2.核心基因结果显示如下，右边列表为核心基因排名，颜色越深分数越高，说明这个基因越显著。可以通过style中的各项修改网络图样式，这里我们修改了图中标识的显示内容，可以看出PTEN同文章中一样，是上调miRNA中的关键核心基因。
3.同样的，我们可以调整网络图布局进行输出，得到如下结果：
本次Cytoscape使用介绍就到这里，更多介绍可以查看中文手册以及相关插件的对应使用手册。
参考文献
[1] Szydełko J, Czop M, et al. Identification of plasma miR-4505, miR-4743-5p and miR-4750-3p as novel diagnostic biomarkers for coronary artery disease in patients with type 2 diabetes mellitus: a case-control study. Cardiovasc Diabetol. 2024;23(1):278.
[2] Locard-Paulet, Marie et al.Functional Analysis of MS-Based Proteomics Data: From Protein Groups to Networks.Molecular & Cellular Proteomics, Volume 23, Issue 12, 100871.
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