一、技术原理
在植物科学的研究中，解析转录因子与DNA的互作机制，是构建基因表达调控网络的核心基础。传统的ChIP-seq技术依赖高质量特异性抗体，这一局限性使非模式植物的研究面临巨大挑战。DAP-seq（DNA Affinity Purification Sequencing，DNA亲和纯化测序）技术的出现，为研究模式和非模式植物基因表达调控机制，提供了高效解决方案。DAP-seq的原理是通过体外表达出含有标签（如His、Halo标签）的目的蛋白，并将其与标签特异性配体结合，然后富集DNA，使用高通量测序与生物信息学分析，在全基因组范围内鉴定转录因子的结合位点（TFBS）。该技术无需目的蛋白特异性抗体，无需转基因材料，即可揭示转录因子与DNA的互作网络，已成为植物学、微生物学等领域解析基因表达调控网络的关键技术手段。
蓝景科信DAP-seq技术路线图
二、技术优势
1. 不依赖目的蛋白特异性抗体
无需目标蛋白特异性抗体，仅需标签配体，即可完成对DNA的富集，尤其适合缺乏抗体的非模式生物。
2. 无需构建转基因材料
通过体外表达系统高效生产目的蛋白，解除了内源蛋白表达量低、组织特异性表达或其他因子干扰的限制。
3. 适用于不同物种
蓝景科信已将DAP-seq成功应用于200多个物种，涵盖植物、动物、真菌及细菌。实验流程可根据物种特性灵活优化。
4. 双DNA亲和纯化测序（dDAP-seq）技术
能够在体内基因组背景下绘制相互作用转录因子（二聚体）的全基因组结合位点，为研究转录因子相互作用如何调节结合特异性、潜在靶基因和生物学功能提供了有力工具。
三、技术发展与影响力
自2016年DAP-seq在《Cell》发表，2017年实验方法在《Nature Protocols》正式发布后，DAP-seq迅速成为解析转录因子调控机制的关键技术。截至目前，蓝景科信使用该技术，已助力科学家在植物生长发育、逆境胁迫响应、果实发育、系统进化等多个研究方向取得突破，相关研究成果发表于Cell、Molecular Plant、Plant Biotechnology Journal、Plant Cell、PNAS、Plant Communications、New Phytologist、Plant Physiology等期刊。
四、蓝景科信实战案例：DAP-seq在高分文章中的应用
应用场景一：解析植物生长发育调控网络
案例1：DAP-seq助力解析拟南芥WRKY1转录因子促进一次结实衰老的分子机制
发表时间：2024年7月
期刊：Cell（IF=17.1）
题目：Arabidopsis WRKY1 promotes monocarpic senescence by integrative regulation of flowering, leaf senescence and nitrogen remobilization
研究背景：
一次结实衰老在种子植物中普遍存在，影响作物收获时间和品质，但外界和内部信号如何系统性整合调控该过程的机制尚不明确，尤其是WRKY转录因子在其中的作用有待探究。
主要结果：
研究发现，WRKY1的表达受年龄、水杨酸（SA）和氮缺乏诱导，其过表达株系（WRKY1-OE）表现为开花提前和叶片早衰，而wrky1突变体则延迟开花和衰老。通过DAP-seq与RNA-seq联合分析，鉴定出WRKY1的直接靶基因：
1. 开花调控：WRKY1直接结合开花抑制基因FLC的启动子（如W1-W3位点），抑制其表达，从而激活FT和SOC1，促进开花转换。
2. 叶片衰老调控：WRKY1靶向SA生物合成基因SID2和PBS3的启动子（如SID2的W2/W4、PBS3的W1-W3位点），激活SA合成，加速叶片衰老。
3. 氮素再分配调控：WRKY1结合氮同化基因NIA1、NRT3.1等的启动子，增强硝酸盐还原酶和转运蛋白的表达，促进氮从衰老叶片向种子的再分配。
本文通过DAP-Seq在全基因组范围内鉴定出拟南芥WRKY1转录因子的结合位点以及保守结合基序，系统性揭示了WRKY1在单稔衰老中的靶基因网络，特别是其对SA生物合成、氮代谢和FLC开花通路的直接调控。这些结果通过ChIP-qPCR、EMSA、双荧光素酶报告基因实验及遗传分析等多维度验证，形成了“结合预测-分子互作-功能表型"的完整证据链，为阐明WRKY1调控单次结实衰老机制提供了关键依据。
案例2：DAP-seq助力揭示叶绿体生物发生的调控机制
发表时间：2024年7月
期刊：Cell（IF=45.5）
题目：MYB-related transcription factors control chloroplast biogenesis
研究背景：
叶绿体生物发生对植物光合作用至关重要，已知GLK家族转录因子是主要调控因子，但其单基因突变体仍有残留叶绿素，暗示存在其他协同调控因子，而MYB相关转录因子在叶绿体发育中的作用及其与GLK的互作机制尚不明确。
主要结果：
已知GLK是叶绿体发育的主调控因子，但GLK突变体仍有残留叶绿素，DAP-Seq证明MYB相关因子通过直接调控光合系统组装和碳代谢基因，弥补了GLK缺失的功能，揭示了叶绿体发育的双重调控机制。
本文通过DAP-Seq在全基因组范围内鉴定了地钱（Marchantia polymorpha）中MYB相关转录因子MpRR-MYB2和MpRR-MYB5的结合位点，结果显示二者分别有6,804个和2,839个结合峰，43%（MpRR-MYB2）和35%（MpRR-MYB5）位于启动子区域，且共享保守基序TTATC。靶基因功能富集于叶绿素生物合成、光合系统组装、碳固定和光呼吸通路，且与GLK调控网络存在协同互作（如MpGLK启动子含MYB结合位点）。这一结果系统性揭示了MYB因子在叶绿体发育中的直接调控作用，弥补了GLK调控的空白，是解析叶绿体双重调控机制的关键，为构建“MYB-GLK协同调控网络"提供了分子证据。随后通过ChIP-qPCR证实体内结合，酵母单杂交和双荧光素酶报告实验验证直接互作，地钱和拟南芥双突变体表型及跨物种互补实验进一步确认功能保守性。
应用场景二：揭示植物胁迫响应机制
案例3：DAP-seq助力揭示提升棉花耐镉能力的新机制
发表时间：2024年1月
期刊：Plant Biotechnology Journal（IF=13.8）
题目：GhRCD1 promotes cotton tolerance to cadmium by regulating the GhbHLH12–GhMYB44–GhHMA1 transcriptional cascade
研究背景：
镉是常见有害重金属，威胁作物与食品安全，易被植物吸收进入食物链。植物修复是有效治理途径，棉花作为非食用经济作物，修复土壤镉污染具天然优势，可避免镉进入食物链，探究其响应镉胁迫的调控机制意义重大。
主要结果：
本文揭示了棉花中GhRCD1通过调控GhbHLH12–GhMYB44–GhHMA1转录级联增强镉（Cd²⁺）耐受性的分子机制。其中通过DAP-Seq在全基因组范围鉴定了GhMYB44的靶基因网络，尤其是重金属转运基因GhHMA1/5的直接调控关系。结合Y1H、EMSA、双荧光素酶报告实验和遗传实验，证实了GhMYB44通过G-box元件激活GhHMA1转录，并与ABA信号通路协同调控棉花Cd²⁺耐受。DAP-Seq数据为解析GhMYB44在Cd²⁺耐受中的作用提供了分子基础，补充棉花重金属转运调控网络的空白。
案例4：DAP-seq助力解析大麦HvbZIP87基因提高小麦抗病高产的新机制
发表时间：2025年5月
期刊：Journal of Advanced Research（IF=11.4）
题目：Heterologous expression of the barley-specific HvbZIP87 transcription factor in wheat enhances broad-spectrum disease resistance with balanced yield
研究背景：
小麦和大麦等禾本科作物的系统获得性抗性（SAR）分子机制尚不明确，尤其是NPR1与bZIP转录因子的互作网络在抗病中的作用需进一步探究，且开发新的广谱抗病基因对小麦抗病育种具有重要意义。
主要结果：
基于HvNPR1大麦转基因株系转录组数据、系统发育分析及核定位特征，锁定HvbZIP87为大麦特异性SAR相关转录因子。随后进行DAP-seq实验，结果显示HvbZIP87直接调控PR基因和锌转运相关基因（如TaZIP5、TaZIP9），保守结合基序为“TGACGTCATCATG"。结合RNA-seq数据，证实其在无病原物条件下即可激活PR基因表达，触发系统性获得抗性（SAR）。DAP-seq系统性揭示了HvbZIP87在小麦基因组中的结合靶点，明确其通过顺式元件直接激活PR基因和锌转运基因，而非依赖病原菌诱导，揭示了其调控小麦抗病性的转录调控网络，为功能验证提供了直接依据。
应用场景三：挖掘植物品质形成机制
案例5：DAP-seq技术助力挖掘水稻香气形成的关键调控因子
发表时间：2024年11月
期刊：Molecular Plant（IF=17.1）
题目：Volatilome-based GWAS identifies OsWRKY19 and OsNAC021 as key regulators of
rice aroma
研究背景：
香米因其的香味而受到全球的青睐，尽管2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）是水稻香气的主要成分，但除2-AP外水稻香气的代谢基础及香气代谢物积累的遗传机制（除OsBADH2和OsODC外）尚未明确，解析水稻香气的分子调控机制对香稻品种培育具有重要意义。
主要结果：
本文通过挥发组全基因组关联研究（vGWAS）结合分子生物学技术，鉴定到两个调控水稻香气的关键基因：OsWRKY19和OsNAC021。OsWRKY19通过DAP-seq以及ChIP-qPCR、EMSA、双荧光素酶报告实验被证实直接结合OsBADH2启动子的W-box元件（TTGACC/T），抑制其转录，从而促进2-AP积累；OsNAC021则通过结合脂氧合酶（LOX）通路基因（如OsADH1、OsADH2、OsLOX9）启动子的NACRS元件，负调控FAVs合成。最终揭示了水稻香气调控的双转录因子模块及其机制。DAP-seq实验为解析OsWRKY19调控水稻香气代谢及农艺性状的分子机制提供了直接证据。
案例6：DAP-seq助力揭示软枣猕猴桃果实变色机制
发表时间：2025年4月
期刊：Molecular Horticulture（IF=10.6）
题目：Chromosome-level genome assembly assisting for dissecting mechanism of anthocyanin
regulation in kiwifruit (Actinidia arguta)
研究背景：
软枣猕猴桃（Actinidia arguta）因果实富含花青素而受市场欢迎，但其花青素合成的分子调控机制尚不明确，且缺乏红色品种的染色体级基因组，限制了相关基因挖掘和分子育种研究。
主要结果：
本文通过染色体水平的软枣猕猴桃品种‘天元红’基因组组装（N50=21 Mb）及比较基因组分析，结合RNA-seq筛选到负调控花青素合成的bHLH转录因子AaBEE1。利用DAP-seq在软枣猕猴桃中鉴定出AaBEE1的457个高置信度结合峰，主要分布于转录起始位点上游2 kb内的启动子区域，保守结合基序为G-box（CACGTG），靶基因显著富集于类黄酮生物合成通路，其中直接靶向花青素合成关键基因AaLDOX启动子的G-box元件。通过酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、染色质免疫共沉淀PCR（ChIP-qPCR）和双荧光素酶报告系统（LUC）验证其直接抑制AaLDOX表达。此外，AaLDOX启动子区29 bp插入/缺失（Indel）变异与果实颜色高度关联，携带插入变异的红色品种中AaLDOX启动子活性更高，而缺失变异的绿色品种中AaBEE1结合增强，抑制基因表达。本研究构建了“AaBEE1-AaLDOX"调控模块，DAP-seq是解析AaBEE1调控机制的核心技术，为揭示了软枣猕猴桃花青素合成的分子机制提供了关键数据。
蓝景科信：提供DAP-seq技术服务的优质合作伙伴
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