在生物学研究中，系统发育分析是揭示物种进化关系的核心手段，而MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）软件凭借其强大功能与友好界面，成为科研人构建系统发育树的得力助手。无论是刚入门的科研小白，还是想提升分析效率的老手，这篇全流程教程都能帮你轻松掌握MEGA系统发育分析的核心操作！
一、前期准备：数据与软件就位
1. 数据获取
首先，需要准备用于分析的序列数据，可以是DNA、RNA或蛋白质序列。常见的数据来源包括NCBI数据库、Ensembl数据库等。下载数据时，建议将序列保存为FASTA格式，该格式以“>"开头标注序列名称，后续MEGA软件能直接识别。
2. MEGA软件安装
前往MEGA网站下载对应系统版本（Windows、Mac或Linux），安装过程一路默认即可。目前最新版本为MEGA 12，功能更强大，操作更流畅。
MEGA软件的页面如下图所示，选择对应系统和版本后，点击DOWNLOAD按钮进行软件下载。
用户协议页面，下拉到最后点击Accept跳转到下一个页面：
填写完毕相关信息后，继续点击DOWNLOAD。
弹出此页面后稍等几秒钟即可开始下载，下载完毕后安装即可使用：
二、实战操作：从序列比对到进化树构建
总共分为4步：序列导入，序列比对，系统发育树构建，结果保存。接下来请看详细步骤。
1. 序列导入
（1）首先需要准备一个fasta格式的序列文件，里面是需要进行比对的序列。
（2）打开MEGA软件，点击菜单栏“File"→“Open A File/Session"，选择已准备好的FASTA文件，点击align进行比对。导入后，数据会显示在主窗口中，此时可先检查序列长度、名称是否正确。
（3）点击后的页面如下，点击“File"→“Font"可以对字体进行调节。
2. 序列比对
（1）多序列比对（Multiple Sequence Alignment）：点击“Alignment"→“Align by ClustalW"或“Align by MUSCLE"，软件将快速完成比对。
（2）这里以ClustalW为例，上方点击Align by ClustalW后，出现如下的参数选择页面，一般情况下全部使用默认参数即可，点击右下角的OK选项进行比对。
（3）比对完成后界面如下，比对完成的序列可以通过点击“Data"→“Save Session"保存比对结果，格式为“.meg"。
3.系统发育树构建
（1）选择建树方法：点击“Phylogeny"，常见方法有邻接法（Neighbor-Joining, NJ）、最大似然法（Maximum Likelihood, ML）等。NJ法计算快，适合初步分析；ML法更精确，适合复杂数据集。
（2）参数设置：以NJ法为例，点击“Construct/Test Neighbor-Joining Tree"，在弹出窗口中，“Test of Phylogeny"选择“Bootstrap method"，一般设置1000次重复以评估树的可靠性；选择用p-distance方法进行计算，其他参数保持默认即可。
（3）这样，我们就得到了系统发育树图。注意这里有两张图，第一张original tree是可以通过分支长度表达遗传距离的图，第二张bootstrap consensus tree是有自展值的图。一般情况下选用origin tree图即可。
进化树解读
l 分支长度：代表序列间的进化距离，越长说明差异越大。
l Bootstrap值：分支上的数值（如>70%）越高，表明该分支可靠性越强。
l 聚类关系：同一分支的物种亲缘关系更近，反映进化历程。
（4）通过菜单栏和左侧的工具栏，可对生成的系统发育树进行美化，这里选择把系统发育树从长条状变成圆形，同时也可以编辑分支的粗细和字体等。
4. 结果保存
（1）保存树文件：点击“File"→“Export Current Tree (Newick)"，选择“.nwk"格式，方便后续用其他软件编辑。
（2）保存图片：右键点击树图空白处，选择“Copy to Clipboard"或“Export Image"，支持PNG、PDF等格式，满足论文投稿或汇报需求。
保存选项可以选择是否保留分支长度和自展值，建议都勾选上。
（3）最后推荐一个可以美化进化树的在线iTOL，上传保存的进化树文件后，可以进行更加精细的美化。
三、避坑指南：新手常见问题解决
序列比对错乱：检查序列是否有非标准字符（如空格、特殊符号），或尝试更换比对算法。
Bootstrap值过低：可能是数据量不足或序列差异过大，可增加样本或调整建树方法。
软件闪退：关闭不必要的后台程序，或尝试降低参数（如减少Bootstrap重复次数）。
四、文献案例
文章标题：Anther-specific expression of MsMYB35 transcription factor in alfalfa (Medicago sativa L.) and its crucial role in pollen development
中文：紫花苜蓿中MsMYB35转录因子的花药特异性表达及其在花粉发育中的关键作用
发表年份：2025年
期刊：The Plant Journal
研究背景：
紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一种优质的饲料作物，是畜牧业的重要资源。了解紫花苜蓿雄性不育的分子机制对于开发优质牧草品种至关重要。尽管花药发育在植物繁殖中起着关键作用，但其分子调控机制，特别是转录因子在苜蓿中的参与仍未得到充分探索。
研究结果：
首先通过Protein BLAST，显示MsMYB35与其他物种的MYB35家族成员具有高度序列相似性，系统发育分析显示MsMYB35与拟南芥的MYB转录因子密切相关。此外，系统发育树使用了来自多个物种的同系物进行树木分析，结果（图1A）表明MsMYB35与MtMYB35、PsMYB35、TrMYB35和GmMYB35 密切相关，形成一个具有高bootstrap值的强进化枝 （100），表明具有相当大的进化相似性。将MsMYB35与M. truncatula、Melilotus albus、G. max、P. sativum、T. repens和A. officinalis的氨基酸序列进行同源氨基酸序列比对。结果表明，MsMYB35包含R2R3-MYB家族的经典R2R3结构域（图1B）。
基于对MsMYB35蛋白N端R2R3结构域的鉴定，将其归入R2R3-MYB转录因子家族。综合DAP-seq和RNA-seq分析显示，MsMYB35直接调控两个关键的花药发育相关基因。功能分析表明，MsMYB35的过表达促进花药发育，而沉默MsMYB35会导致花药囊缺陷和花粉粒起皱。适当的MsMYB35表达可确保形成有活力和可育的花粉粒，巩固其作为花药发育关键调节因子的作用。
图1. MsMYB35的氨基酸序列比对和系统发育分析。
根据以上内容可以看出，系统发育分析的意义在于它帮助我们理解物种之间的进化关系。通过构建系统发育树，我们可以直观地展示不同物种或同一物种不同族群之间的亲缘关系。这种分析不仅用于研究物种的起源和演化，还能为生物分类、生态学研究和疾病控制提供重要信息。系统发育分析通过数理统计方法，能够揭示生物间的相似性和差异性，从而为生物学研究提供科学依据。
参考文献：
Cai H, Zhang S, Wang Y, Yang Z, Zhang L, Zhang J, Zhang M, Xu B. Anther-specific expression of MsMYB35 transcription factor in alfalfa (Medicago sativa L.) and its crucial role in pollen development. Plant J. 2025 Apr;122(1):e70126.
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