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siPOOLs常见问题解答(FAQ)

更新时间:2023-08-07   点击次数:361次

1. siPOOLs如何提高基因敲低的特异性和效率?

siPOOL是一款包含30条siRNAs的、高复杂度的混池,通过降低每条siRNA的实验相关性以稀释其脱靶效应。专有的siPOOL设计算法,可确保较高的转录本覆盖率,且避免旁系同源基因,提高基因敲低的效率和特异性。此外,生产的siPOOL包含了规定长度和高纯度的siRNA标准品,从而大大降低非特异性影响的风险。

2. siPOOLs与其他市售siRNA池有什么区别?

其他市售siRNA池要么是3-4个siRNA的低复杂度混池,要么是不同siRNA长度的随机混池。相比之下,siPOOLs是一款好用、高复杂度、确定长度的siRNA混池。

3. 如果我订购一个siPOOL,总量有多少?我可以用它做多少个反应?

对于每个靶基因,siPOOL的规格有5、10或20 nmol。当siPOOL浓度为1nM时,5 nmol至少足够用于6孔板的2250个孔或者96孔板的45000个孔(参见siPOOL转染方案)。10个及以上的siPOOL批量订单,可以定制1-2 nmol的小规格。请联系我们获取定制报价。

4. 从下单到交货需要多长时间?

我们需要大约3-4周的时间来交付新的siPOOL。而对于已有库存的siPOOLs,可在2周内交货。根据序列的不同,某些siPOOLs可能需要更长的时间来合成。我们将会根据实际情况及时和您沟通是否会延迟交货。

5. siPOOL可以针对的最小序列长度是多少?

通常,目标基因的特异性序列≥300个碱基就可以设计siPOOL。在保持种子序列多样性的条件下,siRNA之间存在一定程度的序列重叠是没有问题的。请将您的序列信息发送给我们,经过评估后我们会告知您设计的可行性及建议。

6. 购买siPOOL有什么保证呢?

针对所有编码基因的siPOOLs均在包含验证的保证范围内。当以高达10nM浓度使用siPOOL,且在转染24小时后做RNA定量检测分析,我们保证敲低率≥70%。在表达给定靶标的标准细胞系中,阳性对照siRNA应获得最佳的转染条件。如果没有看到≥70%的敲低率,我们将根据可用的序列免费为客户重新设计、合成、验证和发货一个新的siPOOL。由于敲低效率也会随着基因的特性而发生变化,因此使用新的siPOOL能否提高敲低效率,我们无法做出保证。

针对非编码基因的siPOOL,如果未达到≥60%的敲低率,则根据可用的序列进行重新合成。不过,验证和运输的费用需由客户自己承担。

7. 为什么不提供针对长非编码RNA(lncRNA)的siPOOL验证?

由于二级结构、结合蛋白或细胞定位等因素限制了RNAi机制发挥作用,因此通过RNAi沉默长非编码RNA(lncRNA)更具挑战性。根据可用的转录序列,我们将提供一轮siPOOL重新设计和合成,以靶向lncRNA的不同区域。然而,siPOOL的验证工作最好还是由熟悉该lncRNA特性的客户自己开展。

8. 可以提供免费样品进行测试吗?

目前,只有0.1 nmol阳性对照(GAPDH / KIF11 / INCENP)和阴性对照siPOOLs可供免费测试。我们欢迎您对经常评估的基因提出建议,未来将有可能会将其作为阳性对照。

9. 能否以更低的价格提供较小规格的siPOOL给到我们进行测试或筛选?

≥ 10个 siPOOLs的批量订单,可以提供较小的规格,如1-2 nmol。人激酶siPOOL库和siPOOL癌症工具箱中的预定义siPOOLs也可用于制定较小的规格。请联系我们获取报价。

10. 对于核定位的RNA,siPOOLs有效吗?

已经有存在于细胞核中的RNAi机制的相关报道,一些针对核定位RNA(例如MALAT1,XIST)的siPOOLs可以达到70%的敲低效率。然而,细胞质定位的RNA可能会更有效地被RNAi靶向。

11. siPOOLs可以组合在一起同时敲低几个基因吗?

是的。siPOOLs在低纳摩尔浓度下是有效的。这允许在单个应用中组合多个siPOOLs,以沉默多个基因,同时将副作用的风险大大降低。

在一项研究中,siPOOLs同时成功地沉默多达四个基因的表达 [Welsbie, D. S. et al. Enhanced Functional Genomic Screening Identifies Novel Mediators of Dual Leucine Zipper Kinase-Dependent Injury Signaling in Neurons. Neuron 94(6), 1142–1154.e6 (2017)]。

12. 我应该使用什么浓度的siPOOL?

在标准细胞系(例如HeLa,Hek293,A549,MCF7)中,siPOOL通常在借助脂质体转染试剂的情况下采用1-3 nM的浓度。在难转染的细胞中,可能需要更高的浓度,并且可以采用电穿孔等替代方法。我们建议先设置不同的浓度梯度,以确定具有稳定敲低效率的较低浓度。对于长期的基因敲低(>3天),建议使用更高的初始siPOOL浓度。另外,我们也可以为您提供剂量优化服务,我们会采用7个浓度梯度进行试验。如需了解更多信息,请联系我们。

13. siPOOL介导的基因敲低效果能持续多久?

siPOOL敲低基因的持续时间与其他siRNA相似,取决于细胞系和靶基因。基因敲低效果通常可持续4-7天。但是,高增殖率的细胞或高活跃度的基因可能会维持更短的时间。通过siPOOLs的再转染或提高siPOOL初始浓度的转染,也许可以延长基因敲低效果的持续时间。

14. siPOOL可以靶向特定的亚型吗?

已证明,siPOOL能够以高特异性和高效率成功地靶向选定亚型。然而,成功概率还取决于该亚型专有的序列可用性。如有需要,请将您的转录本NCBI ID发送给我们,我们可以为您作出评估。另外,我们还可为您提供跨亚型或物种选择性的siPOOL验证服务。

15. siPOOL的阴性对照是什么?

我们使用不与人类、小鼠和大鼠基因相互作用的标准阴性对照siPOOL(30个siRNAs)。它已在多个细胞系中进行了测试,对细胞增殖、凋亡或细胞形态没有显著影响。另外,我们也可以根据需要提供Scrambled阴性对照siPOOL,对靶siRNA序列进行加扰以避免靶标相互作用,同时保持GC含量的百分比(%)。

16. 您的阳性对照siPOOL是什么,读数是多少?

阳性对照siPOOL是预先经过验证的siPOOL,当转染细胞时会产生确定的表征,表明转染成功。目前,可用的阳性对照siPOOL所对应的基因,包括:人KIF11(3832),可产生有丝分裂停滞和可观察到的细胞死亡现象;人INCENP (3619),可产生在显微镜下可观察到的细胞增大表型;人GAPDH(2597),其不产生可观察到的表型,但通过定量PCR检测GAPDH的RNA水平时,表现为显著的下调。也可提供针对小鼠的GAPDH(14433)和KIF11(16551)的阳性对照siPOOL。

17. siPOOLs可以针对除人类,小鼠和大鼠以外的其他物种吗?

是的,siPOOLs可以针对任何物种。请向我们提供目标物种、宿主系统和目标序列。

18. siPOOLs的转染条件与其他siRNA有什么不同吗?

没有太大的差别。您可以将已经优化好的siRNA转染条件应用于siPOOLs转染中。

19. 有推荐的转染试剂吗?

市面上的转染试剂种类繁多。对于许多常见的细胞系,采用Lipofectamine的转染效果就很好。然而,原代巨噬细胞或非贴壁细胞等细胞类型的转染可能会存在更多的挑战。我们可为您提供细胞系转染优化服务,我们将测试3种转染方法。如需了解详情,请联系我们。

20. siPOOL的保质期是多久?

siPOOLs在-20°C下储存时,至少可以稳定6个月。尽管我们观察到siPOOL在保存几年后仍存在活性,但是,我们推荐您在收到产品后尽快使用,尽量不超过保质期。另外,强烈建议您将较大的体积分装成小体积再进行保存,以避免多次反复冻融影响实验结果。

21. siPOOL可以作为一种可发表的验证方法吗?

是的。siPOOLs不仅可以用于常规的基因敲低实验,而且可以作为其他技术(如CRISPR,单个siRNA或shRNA)的补充验证方法。在使用siPOOLs进行发表时,请引用“siTOOLs Biotech"以及Hannus et al., Nucleic Acids Res, 2014文献。

22. 是否可以进一步的验证siPOOL,例如:开展回补实验?

是的。siPOOL敲低效果的进一步验证,可以采用抗siPOOL回补序列(siPOOL-resistant rescue constructs)来开展,它可以表达siPOOL抗性版本的基因以挽救和恢复目标基因的功能。

23. 是否需要反卷积一个siPOOL,来单独测试siRNAs?

我们不建议对siPOOL进行反卷积,因为这会破坏高复杂性混池化所赋予的高特异性。为了进一步验证siPOOL结果,我们建议使用抗siPOOL回补序列。

24. siPOOL以什么形式发货?它们在室温下稳定吗?

siPOOL以悬浮液的形式发货(10 nM Tris,pH 8.0)。siPOOL经测试可在室温(RT)下稳定至少4周,在37°C下稳定1周,在50°C下稳定24小时。因此,温暖气候条件下的运输延迟,不太对siPOOL的活性产生不利的影响。

25. siPOOL文库是否可用于功能基因组筛选?

是的。我们有一个包含505个siPOOLs的siPOOL人类激酶库,可用于高通量功能基因组筛选,以获得可靠的RNAi效果。另外,用于RNA结合蛋白、E3连接酶和去泛素酶的siPOOL文库,以及其他定制化文库,请联系我们咨询。