Plant Physiol | DAP-seq助力揭示杨树根系抗旱新机制

在全球气候变暖背景下，干旱已成为威胁植物生长的重大挑战。在植物中，根系是干旱胁迫信号的主要感知器，其发育直接影响抗旱能力。然而，在树木中不定根（ARs）和侧根（LRs）对非生物胁迫的协调反应所依据的理论仍不清晰。

近日，东北林业大学-杨静莉研究团队在Plant Physiology（IF=6.5）发表题为PuUBL5-mediated ZINC FINGER PROTEIN 1 stability is critical for root development under drought stress in Populus ussuriensis的研究论文，该研究借助DAP-seq技术揭示了杨树通过“分子开关"PuZFP1协调侧根抑制与不定根伸长的抗旱策略，为抗旱林木的遗传改良提供了新的理论依据。

技术路线

研究结果

PuZFP1含有典型的C2H2锌指结构域（氨基酸43-65）和一个C端高度保守的EAR抑制基序（DLSLRL），与拟南芥AtZP1高度同源（结构相似性＞60%），定位在细胞核与细胞质。RT-qPCR和启动子驱动的GUS染色结果显示，干旱和ABA处理显著诱导PuZFP1表达，并且在于根系分化区（DZ）和伸长区（EZ）特异性表达，与侧根发生和不定根伸长区域重叠。酵母转录激活实验和Gal4-GUS/LUC系统结果表明，PuZFP1是转录抑制因子，并且EAR基序是PuZFP1发挥转录抑制功能的必需结构。通过构建PuZFP1过表达（OE）和RNA干扰（RNAi）株系，发现PuZFP1负调控侧根（LR）形成，正调控不定根（AR）伸长，在杨树根系响应干旱胁迫中发挥关键调控作用。

图1. PuZFP1的生物信息学和表达模式分析。

图2. PuZFP1赋予杨树抗旱能力。

图3. PuZFP1赋予杨树抗旱能力。

进一步研究发现，PuZFP1的稳定性受泛素样蛋白PuUBL5调控。酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和Pull-down实验证实，PuZFP1与PuUBL5直接互作，且PuZFP1通过26S 蛋白酶体途径降解。蛋白酶体抑制剂MG132处理实验进一步表明，阻断蛋白酶体途径可显著抑制PuZFP1降解，验证了该降解机制的依赖性。

图4. PuZFP1与PuUBL5相互作用，并发生PuUBL5介导的降解。

为确定PuZFP1的靶基因，研究团队将DAP-seq和RNA-seq联合分析，鉴定出PuZFP1的下游靶基因PuWRKY46和 PuEGR1。DAP-seq结果显示，PuZFP1主要结合在转录起始位点（TSS）附近，在所有的结合峰中，启动子区占比19%，基因间区占比65%。双荧光素酶报告基因实验表明，PuZFP1对这两个基因的启动子具有转录抑制作用，同时ABA处理抑制了PuZFP1与靶基因启动子的结合。

结合EMSA实验和靶基因功能研究发现PuZFP1通过结合PuWRKY46启动子中的CAGTG元件抑制其转录，进而阻断侧根原基形成；同时，通过抑制PuEGR1（含TTTTGTTT结合基序）的表达，解除对不定根伸长区（EZ）细胞伸长的抑制。

图5. PuZFP1靶基因的鉴定和直接结合验证。

图6. PuWRKY46杨树抗旱能力。

图7. PuEGR1赋予杨树抗旱能力。

结合激素信号分析结果，发现PuZFP1通过协调脱落酸（ABA）与生长素（IAA）信号通路，双向调控根系发育：在根系分化区（DZ），PuZFP1抑制靶基因PuWRKY46的表达，导致该区ABA含量升高、IAA含量降低，ABA/IAA比例升高，从而抑制侧根（LR）原基的形成与萌发；而在伸长区（EZ），PuZFP1抑制PuEGR1的表达，使该区ABA含量降低、IAA含量升高，ABA/IAA比例降低，进而促进不定根（AR）细胞的伸长。这种ABA与生长素的时空比例调控，是PuZFP1介导根系结构适应干旱胁迫的核心机制。

图8. PuZFP1表达与ABA/auxin途径联合调控根系发育。

综上所述，本研究揭示了PuUBL5-PuZFP1模块通过ABA /auxin信号调控根系发育的机制，为杨树抗旱分子育种提供了理论依据。

图9. 杨树PuZFP1-PuUBL5模块响应干旱胁迫下的模型。

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