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叶绿体作为植物光合作用的“能量工厂"，其从原始质体到功能完善结构的发育过程，受核编码转录因子精密调控。目前，被子植物（如拟南芥）中的调控机制已被逐步揭开，但在非种子植物中，这些关键调控因子的功能是否“代代相传"，始终是未解之谜。
2024年12月，发表在Cell Reports上的一篇题为“Streamlined regulation of chloroplast development in the liverwort Marchantia polymorpha》"的研究论文，以地钱为对象，探究了已知叶绿体生物发生调控因子（GLK、GATAs、HY5、SCL-MIR171模块）的功能保守性。该研究借助ChIP-seq明确了MpGLK的直接靶标基因、结合基序及调控特征，联合ATAC-seq共同揭示了MpGLK的结合特性及与开花植物的保守性和分化。
技术路线
研究结果
该研究通过系统发育分析，在地钱中鉴定出被子植物HY5、GLK、GATA和SCL的同源基因，分别为MpGATA4、MpGATA2、MpSCL和MpGLK。随后，作者构建了MpGATA4、MpGATA2、MpSCL-MIR171、MpHY5及MpGLK的敲除突变体，发现地钱中MpGATA4与MpGATA2的缺失，对叶绿素合成及叶绿体发生无显著影响，与拟南芥中同源基因的功能不保守；MpSCL不调控叶绿素含量，仅部分株系叶绿体变大，这也与拟南芥中的情况存在差异；而Mphy5突变体在低温下会出现叶绿素含量降低的条件性表型，Mpglk突变体则表现出叶绿素积累减少、叶绿体变小的特征，二者均与拟南芥类似。综上表明，GLK在地钱叶绿体生物发生中具有高度保守的功能，HY5的条件性作用也具备保守性。
图1. MpGLK、MpGATAs、MpMIR171、MpSCL和MpHY5的敲除突变体
图2. Mpglk调控叶绿体大小与超微结构
为验证MpGATA4、MpGATA2、MpSCL和MpHY5功能缺失等位基因中冗余或代偿性反应是否掩盖了对叶绿体生物发生的影响，作者构建了它们与Mpglk的双突变体，发现其叶绿素含量和表型与Mpglk单突变体无显著差异，且过表达MpGATA4无法挽救Mpglk突变体表型，表明这些基因不存在功能冗余或代偿效应。
图3. MpGATA4、MpGATA2、MpSCL和MpHY5与MpGLK在地钱的叶绿体生物发生中没有表型作用
接着，为验证MpGATA4、MpGATA2、MpSCL和MpGLK是否能激活叶绿体生物合成，作者构建了由强组成型MpUBE2启动子驱动的过表达株系，以EGFP标记质膜便于分析。结果显示，MpGATA4、MpGATA2、MpSCL过表达对叶绿素含量和叶绿体大小无影响，MpGATA2过表达在黑暗中也无生长差异；而MpGLK过表达株系呈深绿色、生长迟缓，叶绿素含量最高达对照组4倍，且其不同版本过表达均影响叶绿素含量及叶绿体大小，还能增大非光合细胞的叶绿体。以上结果表明MpGLK可激活叶绿体生物发生。
图4. MpGLK过表达增加叶绿素含量和叶绿体大小
进一步对相关敲除突变体进行RNA-seq分析，结果显示MpSCL、MpGATA4、MpHY5敲除分别导致243、332、160个基因下调；MpGLK敲除使1065个基因转录丰度降低，与MpGATA4突变体重叠85个基因。三者均影响氧化应激等过程，而MpGLK敲除还影响光合作用和叶绿素合成，对光合基因影响显著，其他基因对光合基因表达控制有限，不足以影响叶绿体发生。
图5. MpGLK调控光合作用相关基因的表达
为确定MpGLK的直接靶点，作者通过ChIP-seq分析，发现了2654个可重复结合峰，其结合RGATTYY基序，与开花植物GLK相似，关联到1326个靶基因。结合ATAC-seq和H3K4me3ChIP-seq分析发现MpGLK结合开放染色质模式与拟南芥一致，40.4%的靶基因在Mpglk突变体中下调，35%在过表达株系中上调，且差异表达基因的结合强度更高，MpGLK靶基因差异表达比例高于开花植物。与五种开花植物对比，仅53个GLK靶基因保守（多参与光合作用），多数不保守。以上结果表明，GLK功能保守但调控网络已显著分化。跨物种互补实验进一步证实了GLK在陆生植物叶绿体生物合成中仍起重要作用，但其作用的转录网络在苔藓与被子植物分化后的4-5亿年间已显著分化。
图6. MpGLK的ChIP-seq揭示了地钱与开花植物之间GLK结合的差异
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