DAP-seq助力揭示SlWRKY14调控番茄果色和品质的新机制

2025年10月1日，浙江大学农业与生物技术学院汪俏梅教授课题组在Cell Reports（IF: 6.9）上在线发表了题为SlWRKY14 integrates carotenoid and flavonoid biosynthetic pathways to regulate coloration and quality of tomato fruits的研究论文，该研究借助DAP-seq技术揭示番茄中的WRKY转录因子SlWRKY14通过“转录激活+表观抑制"双重机制整合类胡萝卜素与类黄酮两大代谢途径，为番茄果实品质改良提供了新靶点与理论依据。蓝景科信为该研究提供了DAP-seq技术支持。

文章主要内容

研究背景

在园艺作物研究领域，番茄因其经济价值与科研模型地位，始终是学者关注的焦点。果实的色泽与营养品质，更是育种工作的核心目标。果实着色与营养品质的形成主要依赖于类胡萝卜素（如番茄红素和β-胡萝卜素）和类黄酮（如柚皮素查尔酮）等次生代谢产物的积累。但现代育种因长期追求产量和耐储运性，导致果实中类胡萝卜素、类黄酮含量显著下降。现有研究已明确两类物质的合成通路，但二者协同调控机制未知。

主要研究结果

核心发现一：SlWRKY14直接调控番茄果实色泽与代谢物积累

1. 定位候选基因SlWRKY14

此前，为解析番茄类胡萝卜素生物合成的转录调控网络，作者以SlPSY1（类胡萝卜素合成关键酶）启动子为诱饵进行了酵母单杂交（Y1H）筛选。该筛选鉴定出了SlWRKY14（基因编号Solyc12g006170），这是一种I类WRKY转录因子。并检测了SlWRKY14在三个代表性番茄品种中的表达水平。结果发现，SlWRKY14均在果实破色期（B期）表达量相对较高，并在果实成熟过程中持续维持高表达水平。

2. SlWRKY14功能验证

作者通过构建SlWRKY14 敲除株系（KO）和过表达（OE）株系，测定不同成熟阶段果实的表型、色素含量及产量相关指标，结果显示SlWRKY14 敲除株系果实呈更深红色，类胡萝卜素含量显著升高、柚皮素查尔酮含量降低；过表达株系果实呈橙黄色，类胡萝卜素含量降低、柚皮素查尔酮含量升高；KO与OE株系的果实成熟启动时间（花期到转色期天数）、乙烯释放峰值、单果重及单株总产量，与WT无显著差异；上述结果表明，SlWRKY14调控果实着色且不影响果实成熟进程。

图1 SlWRKY14调控番茄果实着色，且该过程不依赖于果实成熟进程

核心发现二：SlWRKY14通过“SlWRKY14-SlHDA1模块"表观抑制类胡萝卜素合成

1.SlWRKY14下游调控分子机制探究

为研究SlWRKY14转录调控机制，作者通过DAP-seq鉴定出SlWRKY14在基因组中的7536富集峰，对应3329个靶基因，其中有609个为启动子相关基因，并鉴定到典型的W-box motif。进一步GO和KEGG分析显示这些基因显著富集于色素代谢相关通路，其中包含类胡萝卜素和类黄酮生物合成的关键步骤。联合RNA-seq结果发现类胡萝卜素合成基因（SlDXS1、SlPSY1等）显著下调，类黄酮合成基因（SlPALA、Sl4CL等）显著上调。 SlWRKY14可能通过调控MEP途径与苯丙烷途径之间的代谢流，实现对果实色素代谢的精准调控。进一步ChIP-qPCR（体内）、EMSA（体外）、酵母单杂交（Y1H）、双荧光素酶报告实验证实，SlWRKY14直接结合SlDXS1、SlPSY1启动子并抑制其表达。

图2 SlWRKY14调控类胡萝卜素与类黄酮之间的代谢流

图3 通过DAP-seq和RNA-seq在全基因组鉴定SlWRKY14的结合位点

图4 SlWRKY14直接结合SlDXS1的启动子区域以抑制其表达

图5 SlWRKY14直接结合SlPSY1的启动子区域以抑制其表达

2.探究SlWRKY14对类胡萝卜素生物合成碳流的转录抑制机制

为探究SlWRKY14介导转录抑制的机制，作者以SlWRKY14为诱饵，对通过靶向Y2H实验，检测了SlWRKY14与所有已知SlHDA（组蛋白去乙酰化酶）家族蛋白的相互作用，结果显示，仅SlHDA1能与SlWRKY14发生特异性相互作用，并通过Y2H、Pull-down、Co-IP、LCI证实该结论。随后通过构建SlHDA1-RNAi株系发现SlHDA1作为SlWRKY14的共抑制因子，参与调控类胡萝卜素合成相关基因的表达。通过检测SlWRKY14敲除株系与SlWRKY14 过表达株系果实的整体组蛋白乙酰化水平、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）活性、组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理、ChIP等一系列实验进一步证实，SlWRKY14通过招募组蛋白去乙酰化酶SlHDA1，去除组蛋白在H3K9和H3K27位置上的乙酰基，以降低组蛋白乙酰化水平并增加染色质的紧缩状态，从而抑制SlDXS1和SlPSY1的表达和类胡萝卜素的积累，且该表观抑制不影响SlPALA的激活过程。

图6 SlWRKY14与SlHDA1存在物理相互作用

图7 组蛋白去乙酰化酶的功能性活性是SlWRKY14-SlHDA1复合物抑制类胡萝卜素生物合成基因转录所必需

核心发现三：SlWRKY14激活类黄铜生物合成通路

类黄酮是番茄果实果皮中的主要色素，由SlPAL、SlCHS、SlCHI、SlF3H等酶催化合成，DAP-seq结果显示，类黄酮合成途径中的SlPALA是SlWRKY14直接调控的靶基因，并通过ChIP-qpcr、EMSA、双荧光素酶实验证实SlWRKY14结合类黄酮合成关键基因SlPALA启动子W-box并激活其转录。与抑制类胡萝卜素合成不同，SlWRKY14激活SlPALA无需SlHDA1参与，且未检测到与组蛋白乙酰转移酶（HAT）互作，推测通过未知共激活因子调控。OE株系中SlPALA表达量提升3倍，下游类黄酮合成基因（Sl4CL、SlC4H、SlCHS）同步上调，最终推动类黄酮积累。

图8 SlWRKY14既是类黄酮生物合成的激活因子，也是类胡萝卜素生物合成的抑制因子

小结

综上所述，该研究揭示了SlWRKY14在番茄果色和品质形成中的关键作用。一方面通过直接激活类黄酮途径基因SlPALA，增强类黄酮的积累，另一方面形成SlWRKY14-SlHDA1调控模块表观抑制类胡萝卜素途径基因SlDXS1、SlPSY1，从而抑制类胡萝卜素的合成，实现番茄果色的两条代谢通路差异化调控。为番茄果实颜色及营养品质改良提供了新靶点，具有重要育种应用前景。

图9 SlWRKY14调控番茄果色和品质形成的分子机制