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介绍酵母双杂交的两种构建方法

发布时间:2021-07-25   点击次数:531次
  酵母双杂交技术作为研究蛋白质相互作用的主要方法,在规模化蛋白质相互作用研究中占据举足轻重的地位,已经成为分子生物学研究领域的重要实验手段,因此有不少生物公司提供从构建杂交文库到文库筛选的一站式酵母双杂交服务。但是酵母双杂交技术的分子生物学操作是比较复杂的,包含从基因的载体构建、蛋白质的自激活检测到多次酵母转化和相互作用的确认,对酵母双杂交技术进行改进,可以提高其工作效率。
  目前市场上提供的酵母双杂交服务有核体系和膜体系两种,酵母双杂交与其他相互作用筛选手段相比,最大的优势在于它能够适应基因组水平的高通量筛选。美迪西提供酵母双杂交服务,其具有独立优质的实验室和专业的实验人员,提供详细的酵母双杂交实验步骤、原始数据和图片、结果分析,可以出具检测数据报告。
  为了降低工作量使其更适用于高通量筛选,需要对酵母双杂交技术进行改进,常采用的手段有酵母双杂交阵列筛选技术和规模化载体构建方法。
  1、酵母双杂交阵列筛选技术
  从传统的酵母双杂交技术基础上发展而来的酵母双杂交文库筛选技术能够支持一个诱饵与整个cDNA文库的筛选,可以用于筛选一个蛋白质与整个cDNA文库中的相互作用。但是该技术并不适用于基因组水平的相互作用筛选。
  首先,基因组水平的相互作用筛选需要成千上万的诱饵,而对这些诱饵进行文库筛选工作量极大;其次,由于cDNA片段不同,筛选过程中呈劣势生长的菌株不容易得到筛选;最后筛库同样面临单次筛选只能获得文库中极少部分的相互作用结果。为了适应基因组水平的相互作用筛选,人们开发了酵母双杂交阵列筛选技术。
  阵列筛选法又可分为一对一阵列、高通量阵列法、亚库对亚库法。一对一阵列法含有不同BD-X的菌株和所有含不同AD-Y的菌株一一对应筛选。
  高通量阵列法是把所有不同ORF-AD集合成库,然后与排成阵列的不同BD-X作用的筛选方法,其实质是诱饵数量较大情况下的阵列化文库筛选。亚库对亚库法把总数较大的DBD-X和AD-Y的成员分别编号并分组,每组含一定数量的成员,然后集合每组成员形成亚库(pool),再用猎物亚库对诱饵亚库一一作用,筛选阳性克隆。此法工作量大,获得的阳性克隆的猎物和诱饵都需测序鉴定。
  2、规模化载体构建方法
  规模化酵母双杂交筛选需要构建大量的表达载体,因此载体构建工作的质量和速度对于后续的酵母双杂交筛选至关重要。传统的构建载体的方法是限制酶切-连接方法,可以有效地将目的片段插入载体,然而其操作时间长,需要酶切、连接两步反应,构建成功后的重组质粒需要进行DNA测序来验证其正确性,表达载体的构建过程中存在载体自连、连接困难等缺点,这些缺点使得限制酶切-连接方法不能用于高通量的载体构建。

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