微生物鉴定与微生物多样性测序结合解析复杂样本中的稀有菌群
更新时间：2026-01-30 点击次数：23次
在现代微生物学研究中，复杂环境样本（如土壤、肠道内容物、海洋沉积物或临床标本）中往往包含成百上千种微生物，其中绝大多数为丰度极低的“稀有菌群”（rare biosphere）。这些稀有菌群虽占比微小，却可能在生态系统功能维持、宿主健康调控甚至疾病发生中扮演关键角色。然而，传统培养方法对大多数不可培养微生物束手无策，而单一的高通量测序技术又难以准确鉴定低丰度物种。因此，将经典微生物鉴定手段与新一代微生物多样性测序技术有机结合，成为深入解析复杂样本中稀有菌群结构与功能的有效策略。
一、稀有菌群的研究价值与挑战
稀有菌群通常指在微生物群落中相对丰度低于0.1%甚至更低的类群。尽管其数量稀少，但研究表明，它们具有高度的系统发育多样性，是微生物“种子库”的重要组成部分。在环境扰动（如抗生素使用、气候变化或污染事件）后，部分稀有菌可能迅速增殖，成为优势种群，从而重塑整个微生物生态网络。此外，在人体肠道中，某些稀有致病菌或条件致病菌在特定条件下可引发感染或慢性炎症，因此对其精准识别具有重要的临床意义。
然而，稀有菌群的检测面临多重挑战：首先，高通量测序（如16S rRNA基因扩增子测序）虽然能提供群落整体结构信息，但在低丰度区域易受PCR扩增偏差、测序错误及数据库不完整等因素干扰，导致假阳性或假阴性；其次，宏基因组测序虽可绕过扩增步骤，但对稀有物种的覆盖深度不足，难以实现可靠组装和注释；再者，缺乏有效的富集或分离手段，使得稀有菌难以被单独研究其生理特性。
二、微生物鉴定与多样性测序的互补优势
传统微生物鉴定方法，包括形态学观察、生化试验、质谱分析（如MALDI-TOF MS）以及特异性PCR等，虽通量较低，但具有高特异性和准确性，尤其适用于已知目标菌的确认。而高通量多样性测序则擅长全景式描绘群落组成，揭示未知类群的存在。两者结合，可形成“广筛+精鉴”的研究范式。
例如，在初步通过16S rRNA扩增子测序发现某临床样本中存在潜在致病稀有菌（Elizabethkingia属）后，可设计特异性引物进行qPCR定量，并结合培养富集与MALDI-TOF MS验证其存在与活性。这种策略不仅提高了鉴定的可信度，还能排除测序背景噪音的干扰。
更进一步，近年来发展的靶向富集测序（如基于探针捕获的16S或全基因组富集）技术，可在测序前对目标稀有菌DNA进行富集，显著提升其在测序数据中的比例，从而提高检测灵敏度。在此基础上，结合单细胞分选与全基因组扩增（scWGA），甚至可对无法培养的稀有菌进行基因组水平的解析。
三、整合策略的实际应用案例
在一项关于早产儿肠道菌群的研究中，研究者首先利用16S rRNA测序发现多个低丰度Clostridioides difficile信号，但无法确定是否为活菌或污染。随后，他们采用厌氧培养结合特异性毒素基因PCR，成功分离出活的产毒菌株，并通过全基因组测序确认其毒力基因型。这一整合方法不仅证实了稀有致病菌的存在，还揭示了其潜在致病风险，为临床干预提供了依据。
另一项海洋微生物研究则采用宏基因组测序结合荧光原位杂交（FISH）技术，对深海沉积物中丰度极低的古菌类群进行可视化定位与功能注释。通过设计针对特定16S序列的FISH探针，研究者在显微镜下直接观察到这些稀有古菌的空间分布，并结合宏基因组binning重建其代谢通路，揭示其在氮循环中的潜在作用。
四、未来展望
随着长读长测序、单细胞多组学及人工智能辅助分类算法的发展，微生物鉴定与微生物多样性测序的融合将更加紧密。未来的研究可构建“从群落到单细胞再到功能验证”的完整链条，实现对稀有菌群从存在性确认到生态功能解析的全链条研究。 面对复杂样本中稀有菌群这一“暗物质”，唯有打破技术壁垒，整合多维度方法，才能真正揭开其神秘面纱，为环境微生物学、医学微生物学及合成生物学等领域提供新的认知基础与应用潜力。
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