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EMSA(凝胶阻滞实验)服务

更新时间:2021-10-12

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EMSA(凝胶阻滞实验)服务验证性竞争性超迁移EMSA研究DAN结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术
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EMSA(凝胶阻滞实验)服务

样本要求

1、细胞核蛋白或纯化的转录因子,部分实验亦可使用重组表达的蛋白,依据实验设计每张膜至少提供50 uL,浓度大于0.5 mg/mL

2、探针序列,如无探针序列,请提供DNA结合蛋白相关信息或相关文献,便于技术人员设计探针3、结合蛋白特异性抗体50uL以上,浓度大于0.5 mg/mL

EMSA(凝胶阻滞实验)服务

EMSA凝胶/电泳迁移率实验技术服务常见问题

1、EMSA原理及方法

EMSA 称凝聚阻滞实验或凝胶电泳迁移率检测, 是一种用于研究转录因子和其相关的 DNA 结合序列相互作用的技术, 能对各类转录因子的 DNA 结合活性进行定性和半定量分析,是一项研究细胞信号转导通路的关键实验技术。

EMSA 主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针,当核酸探针与样本蛋白混合孵育时,样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物;这种复合物由于分子量大,在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢,而没有结合蛋白的探针则较快;孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后,蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带,说明有蛋白与目标探针有互作。

2、看不到迁移条带

1)蛋白样本提取质量不高,蛋白降解或者提取量不足。

2)样本中没有可以与探针结合的蛋白。

3)探针与蛋白无特异性的相互作用。

4)转膜效率低,蛋白或者探针未转移到膜上。

5)曝光或者成像时间过短。

6) 在 Super-Shift EMSA 测定中看不到 Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因:

a. 抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于 Super-Shift EMSA,只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于 Super-Shift EMSA。

b. 测定的活化的 DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到 Super-Shift 的带,也看不到 DNA/蛋白复合物的量的减少。

c. 使用的抗体过度稀释。一般 10~20 ul 的反应液需要使用 0.5~1 ul 原倍的抗体。

d. 多抗与 DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下,虽然看不到 Super-Shift 的带,但应当可以看到 DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。

3、实验背景高

1)曝光或者成像时间过长。

2)封闭时间不足或者效率不高。

3)洗涤效果不佳。

4)实验过程中膜没有一直处于湿润状态。

5)蛋白的质量不高,杂质多

4、EMSA如何设置对照实验及其目的

EMSA实验会有如下对照组:
(1)阴性对照反应(标记探针);
(2)常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针);
(3)探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记探针);
(4)突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记突变探针);
(5)Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+目的转录因子的特异抗体)。

EMSA非放射性探针设计注意事项

(1)EMSA探针不宜太长,一般是几十碱基对。太长会产生过多结合位点导致结果分析困难,还会产生超级螺旋结构而掩盖结合部位

(2)注意AT/GC比例

(3)防止产生空间位阻

(4)防止错位配对、封闭成环,排除目标序列以外结合位点

(5)推荐Biotin或红外荧光标记,尽量不要用DIG标记。

相关技术服务:

1、 DNA亲和纯化测序(DAP-seq):高通量检测转录因子或DAN结合蛋白在基因组上的结合位点。

2、 酵母单杂交:DAP-seq后续验证服务

3、 ChIP-seq:高效检测重组蛋白、转录因子在基因组的结合位点

4、 DAP-seq与RNA-seq联合分析: 分析转录因子的靶基因在RNA-seq数据中的表达变化,深入挖掘DAP-seq和RNA-seq测序数据,增加转录组测序的分析深度。

5、 DNA-pull down:鉴定与DNA结合的蛋白。

6、 精美的论文图片设计与制作:专业设计师,设计精美论文插图,提升论文的严谨性和美观度。



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