技术文章您的位置:网站首页 >技术文章 >凝胶阻滞实验的操作方法介绍

凝胶阻滞实验的操作方法介绍

发布时间:2021-09-27   点击次数:56次
  一、凝胶阻滞实验定义
  凝胶阻滞实验(gelreiardadonassay,又称为mobthtyshiftassay)方法简单、灵敏,可以定量的特性使它在研究转录和基因调控中广泛的应用。目前通常用于RNA(或DNA)结合蛋白的纯化,确定一种已知或可能的RNA结合蛋白所识别的序列,建立反应常数(如亲和常数和解离常数)等。
  二、操作方法
  1.RNA和蛋白的结合反应
  (1)冰浴,微量离心管中加入下列试剂,并混匀:末端标记的RNA片段1ng,10X结合缓冲液2μl,末标记的同种RNA适量,待测蛋白适量,加水至20μl。
  (2)37°C温育反应液30min,温度和时间需要通过经验确定,对于大多数反应,30min足够达到平衡。
  2.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
  (1)凝胶可以提前制备。用水和乙醇彻底淸洗玻璃板,使用0.7mm薄垫片,12齿梳子,每齿的尺寸为0.8cmX1.5cm,玻璃板的尺寸为18cmX23cm。
  (2)混合适当的储存液得到40ml的溶液,含有6%丙烯酰胺、0.12%甲叉双丙烯酰胺、25mmol/LTris碱,0.2mol/L甘氨酸、5%甘油,加入15mg过硫酸铵和TEMED,灌注到两玻璃板之间,插入梳子,深度为1~1.2cm,等到完全聚合,在最后的电泳温度平衡凝胶。
  (3)去掉底部的垫片,将凝胶装到电泳槽,在顶部和底部槽中加入电泳缓冲液(25mmol/LTris碱和0.2mol/L甘氨酸),用吸管吹打毎个孔确保孔中的凝胶底部任何空间的气泡被去除,在上样以前300V预电泳凝胶不少于30min。
  (4)上样,300V电泳3h。
  (5)倒空电泳槽,取下凝胶。所有的放射性物质,包括RNA标记反应时未结合的核苷三磷酸仍然留在凝胶中,底部槽中的缓冲液应该没有放射性,但是任何试验参数发生了改变,必须测定底部糟中的缓冲液有没有放射性(在任何情况下此操作都很有必要)。去掉一个玻璃板,依据定量的方法不同,凝胶可以置于Whatman滤纸上在凝胶干燥器中干燥,固定(12%甲醇,10%的乙酸)或直接用塑料膜包裹湿的凝胶直接进行定量。

联系我们

contact us

咨询电话

15632249798

扫一扫,关注我们

返回顶部