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DNA Pull Down常见问题

发布时间:2021-11-04   点击次数:91次

Q1:DNA Pull Down的原理是什么?

A:DNA Pull Down是根据启动子区域,设计DNA探针并进行生物素标记,标记的探针结合到链霉亲和素修饰的磁珠上,形成磁珠-探针复合体。将磁珠-探针复合体与提取的蛋白孵育,鉴定与DNA探针有特异性结合的蛋白质。


Q2:探针的设计原则是什么,长度为多少个碱基比较合适?

A:启动子的长度一般为100-1000 bp,我们建议选择起始密码子上游1000 bp的序列,根据这1000 bp的序列,来设计DNA探针。我们建议探针长度在100 bp-500 bp之间,如果探针序列太短,会降低与蛋白的亲和能力;反之,如果探针序列太长,则会增加非特异性结合。


Q3:做DNA Pull Down的探针,用单链好还是用双链好?

A:转录因子是与启动子区特定的motif结合,DNA双链的正义链和反义链上都可能会有转录因子的结合位点。转录因子与DNA的结合依赖于氢键和范德华力,双链DNA能够增加转录因子与DNA的结合能力。


Q4:一般会找到多少个转录因子,成功率是多少,有没有成功的案例?

A:由于DNA Pull Down的特异性强,假阳性率低,根据我们的实际经验,一条DNA探针能够结合1-6个转录因子。我们目前所做的项目,成功率为80%。我们鉴定出了作物、花卉和木本植物的WRKY、MYB、HD-ZIP、MADS、HSF等转录因子。


Q5:本实验的难点在哪里,影响DNA Dull Down实验的因素有哪些?

A:由于样本的种类多种多样,转录因子的表达丰度低,本实验的难点在于样本细胞核的分离、细胞核蛋白的提取。影响DNA Dull Down实验的因素主要有蛋白的表达丰度、蛋白和DNA结合的强弱程度等。


Q6:SDS PAGE之后,为什么用银染,而不是考染?

A:由于提取或洗脱的蛋白丰度低,所以使用银染进行SDS PAGE后的染色,银染检测灵敏度高,能够检测到ng级的蛋白质。通过银染,也能够判断蛋白提取的质量,以及Pull Down之后蛋白洗脱的效果。


Q7:为什么实验的对照组也能够鉴定出蛋白?

A:如果物种蛋白数据库完整度低、肽段注释质量差,则需要进行全库搜索。全库搜索,对于负对照和实验组来说,往往有非特异性蛋白或肽段。这是因为有一些蛋白能够与磁珠非特异性结合;另外,配制实验缓冲液所用的原料试剂、在实验过程中会有外部环境蛋白的污染,比如人的角蛋白污染。由于质谱鉴定的灵敏度很高,即使有痕量的蛋白污染,也会被检测出来。


Q8:后续的验证可以选择哪些实验?

A:后续可以使用酵母单杂交、EMSA、LUC等实验做进一步验证。

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