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介绍EMSA实验的三种方法

发布时间:2022-01-13   点击次数:12次
  凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)是一种体外研究DNA结合蛋白(转录因子)和其相关的DNA结合序列(靶标基因的启动子序列)相互作用的技术,可用于定性和定量分析。
  通用蛋白质-DNA结合分析试剂盒(比色),用于测量核提取物中转录因子与DNA结合活性。在实验中,含有靶向转录因子的DNA结合共有序列的标记的双链寡核苷酸(寡核苷酸)与结合试验缓冲液中的核提取物一起温育。核提取物中活性形式的转录因子与其共有序列结合。然后将寡蛋白复合物捕获到测定微孔上。靶蛋白可以通过高亲和力抗体识别,并通过检测抗体-显色试剂反应系统进行比色测量。
  EMSA实验根据实验方案设计的不同,分为验证型EMSA、竞争型EMSA、超迁移EMSA。
  一、验证型EMSA
  用于验证探针是否含有可与蛋白质结合的位点。
  探针与纯化蛋白混合孵育,探针与蛋白结合与否,可以直接表明探针和蛋白的互做关系。蛋白提取液中蛋白质混杂,种类不单一,探针可能与多种蛋白结合。因此,探针与蛋白提取液混合孵育,可以验证探针上是否含有蛋白结合位点,但是无法得知是何种蛋白与探针结合。
  二、竞争型EMSA
  与探针序列相同,不含修饰基团的DNA的片段称为冷探针。
  在探针与蛋白质混合液中加入大量冷探针,冷探针含有和探针相同的DNA序列,会干扰探针与蛋白的结合。在电泳图的相应位置处,电泳带的的信号减弱或消失。
  探针和蛋白的结合未必是特异性结合,或者蛋白本身可能含有,二者均能产生假阳性的实验结果。增加一个冷探针的干扰实验,可以排除假阳性结果,增加实验结果的准确性。
  三、超迁移EMSA
  超迁移EMSA利用到了与待检测的目的蛋白特异性结合的抗体。
  如果蛋白质溶液不是单一的纯化蛋白,无论是验证型EMSA,还是竞争型EMSA,都无法证明和探针结合的蛋白质就是我们所预期的。在实验体系中引入特异性抗体,用抗体特异性地结合蛋白-探针复合物,这就是超迁移EMSA。
  蛋白-探针复合物被抗体识别并结合,该三聚复合物在凝胶电泳中,迁移速率再次增大,电泳带出现在蛋白-探针复合物的上方。
  超迁移EMSA是以竞争型EMSA为基础的实验方案。超迁移EMSA的实验结果可以很好的验证探针是否和蛋白结合,是否是特异性结合,与探针结合的蛋白是否是预期的蛋白质。

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