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介绍ChIP技术的三个实验步骤

发布时间:2022-01-21   点击次数:140次
  在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA的片段沉淀下来,以富集存在组蛋白修饰或者转录调控的DNA的片段,再通过多种下游检测技术(定量PCR、基因芯片、测序等)来检测此富集片段的DNA序列。
  ChIP-seq技术实验步骤:
  染色质免疫共沉淀技术包括3个独立的步骤,即固定、沉淀和检测。
  第1步固定
  甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质,蛋白质-DNA,蛋白质-RNA交联,形成生物复合体,防止细胞内组分的重新分布。首先在体内用甲醛固定DNA和蛋白质复合物,需要注意甲醇的交联时间,如果过长,细胞染色质难以用超声波破碎,影响ChIP结果,而且实验材料也容易在离心过程中丢失;交联时间如果过短,则交联不完全,产生假阴性。交联反应可加入终止。然后用化学(微球菌酶)或者机械(超声波)的手段将其随机切成一定长度的染色质小片段(200~1000bp)。
  第2步免疫沉淀
  利用目的蛋白质或者目的蛋白质上标签的特异性抗体,通过抗原和抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合体,然后沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA的片段。
  第3步目的片段的纯化与检测
  经过热处理及交联,释放共沉淀的DNA;再将DNA的片段纯化后,对沉淀的DNA样品进行检测。目前检测方法主要有3种:第1种是比较沉淀的模版与阴性和阳性对照PCR信号强度的普通PCR实验,或者相对精确的定量PCR方法。第2种是将沉淀的DNA与DNA微阵列芯片杂交(ChIP-on-ChIP),以检测多基因轨迹全部的相互作用。第3种是高通量DNA测序分析。

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