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鉴定DNA结合的蛋白-DNA Pull Down技术服务

更新时间:2021-09-28

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简要描述:
鉴定DNA结合的蛋白-DNA Pull Down技术服务
DNA Pull Down是一种新颖的DNA-蛋白互作技术,能够鉴定与特定DNA序列结合的蛋白(转录因子或者DNA结合蛋白)。
DNA Pull Down使用生物素标记的DNA探针作为诱饵,与提取的内源细胞核蛋白进行孵育,捕获与DNA探针特异性结合的蛋白(比如转录因子),最终使用蛋白质谱的方法,鉴定出特异性结合的蛋白。
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鉴定DNA结合的蛋白-DNA Pull Down技术服务

常见问题:

Q1: 你们的探针是怎么设计的,长度是多少?

A: 探针设计采用的是生物素标记的DNA探针,我们推荐基于启动子转录起始位点上游1000 bp或2000 bp设计探针。探针太小亲和性差,探针太长非特异性结合增多,根据经验,我们建议探针长度在100 bp-500 bp之间。 


Q2: DNA pull down的原理是什么?

A: 针对目标区域设计特异性DNA探针并进行生物素标记,生物素探针可与偶联在磁珠上的链霉亲和素结合;细胞蛋白提取物与磁珠-DNA探针孵育,从而钓取与DNA探针有特异性结合的互作蛋白质。


Q3: DNA pull down效率有多高?

A: 效率主要取决于蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。


Q4: 为什么用银染?

A: 银染检测灵敏度高,可检测到ng级别的蛋白质。


Q5: 可以简单讲一下生物素标记引物的原理吗?

A: 主要利用生物素(biotin)和链霉亲和素(streptavidin)这两种分子的独特性质; 链霉亲和素的每个亚基都能结合一个生物素分子,两者的结合是通过生物素的脲基环部分完成的; 因此可将其戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连,构成生物素标记的核酸探针。


Q6: 未加探针的对照组鉴定出蛋白是什么原因呢?

A: 对照组是磁珠beads+蛋白,虽然没有探针,但少量蛋白可以与磁珠相结合,对照组鉴定到的蛋白是非特异性的背景蛋白。


Q7: DNA pull down有什么缺陷吗?

A: DNA pull down-MS是体外研究蛋白-DNA是否有直接互作的经典技术,是将探针结合在凝胶/磁珠上,钓取与DNA探针有互作的蛋白;就技术而言,没有明显的缺陷;后续质谱能鉴定到多少蛋白取决于蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。

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